La breviscapine remodèle le métabolisme myocardique du glucose et des lipides en régulant la sérotonine pour atténuer la cardiotoxicité induite par la doxorubicine

Réactifs

Les réactifs suivants ont été utilisés : DMEM, FBS, pénicilline/streptomycine (Meilunbio, Dalian, Chine), kits cTnI Elisa (Sangon Biotech, Shanghai, Chine), kits TNF-α, IL-1β et IL-6 Elisa (MyBioSource, San Diego, États-Unis), kits MDA, kits SOD et kits NADH (Solarbio, Pékin, Chine), kits CCK-8 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine), kits fluorimétriques ROS, colorant fluorescent JC-1, kits d'extraction de protéines et kits BCA (Meilunbio, Dalian, Chine). IL-1 (1:100), PINK1 (1:1 000), Parkin (1:1 000), AMPK (1:1 000), Akt (1:1 000), P13K (1:1 000), Tom20 (1:1 000) , la β-tubuline (1: 1 000), mTOR (1: 1 000) et un anticorps GAPDH conjugué à la HRP (1: 1 000) ont été obtenus auprès d'Abclonal Biotechnology (Wuhan, Chine). Le tampon de lyse RIPA et le tampon de chargement ont été achetés auprès de Meilunbio (Dalian, Chine). Les membranes PVDF ont été obtenues auprès de Merck (New Jersey, États-Unis). Le DMSO a été acheté chez Macklin (Shanghai, Chine) et la doxorubicine, la breviscapine et le dexrazoxane ont été achetés chez Widely (Wuhan, Chine). L'inhibiteur Mdivi-1 a été acheté auprès de Selleck Chemicals (Houston, États-Unis).

Conditions de culture cellulaire et lignées cellulaires

Le milieu de culture et les suppléments pour la culture cellulaire ont été achetés auprès de Gibco-Invitrogen (Carlsbad, Californie, États-Unis) et les ustensiles en plastique ont été achetés auprès de Corning (Corning, NY, États-Unis). Des cellules de cardiomyoblastes embryonnaires H9c2 dérivées du cœur de rat (ATCC, CRL-1446) ont été cultivées dans du DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal, 100 unités/ml de pénicilline G sodique et 100 µg/ml de sulfate de streptomycine (37°C, 5% CO₂). Des cellules de cancer du sein métastatiques humaines MCF-7 (iCell, iCell-h129) ont été cultivées dans 1 640 milieux additionnés de sérum bovin fœtal 10%, 100 unités/ml de pénicilline G sodique et 100 µg/ml de sulfate de streptomycine. Des cellules de cancer du sein de souris 4T1 (ATCC, FS-0158) ont été cultivées dans un milieu DMEM additionné de sérum bovin fœtal 10%, 100 unités/ml de pénicilline G sodique et 100 µg/ml de sulfate de streptomycine.

Les cellules ont été passées régulièrement lorsqu'elles ont atteint la confluence 80-90% et ensemencées dans des plaques à 96 puits (1 × 10⁴ cellules/puits). Les cellules H9c2 ont été exposées à un contrôle, 5 µM de Dox (Guo et coll., 2013), 5 µM Dox + 20 µM Dexra (Sangweni et coll., 2020), ou 5 μM de Dox + 200 μM de breviscapine (Li et coll., 2022) pendant 24 h, respectivement. Les cellules traitées uniquement avec du DMEM ont été utilisées comme contrôles à blanc et Dexra a été utilisé comme contrôle positif. Enfin, nous avons également injecté du Mdivi-1 (5μM, dans du DMSO), un inhibiteur de la division mitochondriale (Nhu et coll., 2021).

Évaluation du stress oxydatif

Les niveaux de ROS intracellulaires ont été mesurés à l'aide du colorant fluorescent DCFH-DA conformément aux instructions du fabricant. En bref, une solution de DCFH-DA (1 µM) a été préparée dans du PBS et ajoutée à des cellules H9c2 cultivées dans une plaque à 6 puits avant incubation à 37 ° C pendant 30 min. Après incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS. Des photomicrographies fluorescentes ont été prises avec un grossissement de 20 × à l'aide d'un microscope à fluorescence de Leica Microsystems, Ltd. Les niveaux de ROS ont été quantifiés avec un cytomètre en flux Beckman (Beckman, Californie, États-Unis).

Détermination des indices enzymatiques

L'activité de la SOD et du NADH a été mesurée à l'aide d'un kit de test d'activité conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance et la luminescence ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de microplaques (Perkin Elmer, Massachusetts, États-Unis).

Microscopie électronique

Les cellules ont été fixées avec un fixateur de glutaraldéhyde 0, 51 TP3T à 4 ° C pendant 15 à 30 min et ont été collectées par centrifugation à 10 000 à 13 000 tr / min pendant 5 min. Les cellules ont ensuite été fixées avec du glutaraldéhyde 3% à 4 ° C pendant une nuit, puis traitées avec du tétroxyde d'osmium 1% à température ambiante pendant 2 h. Ensuite, les échantillons ont été déshydratés dans un gradient d'acétone, incorporés dans de l'Epon 812, soumis à un positionnement optique et découpés en sections ultrafines. Les coupes ont été doublement colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. L'ultrastructure mitochondriale a été examinée à l'aide d'un microscope électronique à transmission H-7650 (Hitachi, Toyko, Japon).

Détermination de la respiration mitochondriale

Environ 10⁶ les cellules ont été utilisées pour mesurer la respiration mitochondriale avec un respiromètre O2K (Oroboros Instruments, Autriche). La concentration en oxygène a été déterminée et analysée à l'aide du logiciel Oroboros DatLab 7.4. En bref, un état respiratoire de fuite a été enregistré dans les cellules seules, le transfert d'électrons a été couplé à la phosphorylation par l'ajout de 5 mM d'ADP et une respiration d'état 3 soutenue par le complexe I a été enregistrée. La respiration maximale à l'état 3 avec apport d'électrons parallèles du complexe I et du complexe II a été enregistrée grâce à l'ajout de 10 mM de succinate, et la respiration soutenue par le complexe II a été mesurée en présence de 6,25 µM de roténone. La capacité maximale de transfert d'électrons a été enregistrée en présence de 5 µM de cyanure de carbonyle p-(trifluoro-méthoxy)phényl-hydrazone (FCCP). Enfin, de l'antimycine (Ama), qui complète le complexe Ⅲ et bloque tout transport d'électrons, a été administrée et le taux de consommation d'oxygène a été mesuré en tant que consommation d'oxygène non mitochondriale.

Détermination des modifications du potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm)

La coloration à l'iodure de 5,5 ', 6,6'-tétrachloro-1,1 ', 3,3'-tétraéthylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1) a été utilisée pour évaluer le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules H9c2. En bref, selon les conditions expérimentales prédéterminées, les cellules H9c2 ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) chaude avant d'être colorées avec 100 μL de solution JC-1 2 μM (mélangées dans du DMEM sans rouge de phénol) et incubées sous culture cellulaire standard. conditions pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après incubation, les cellules ont été lavées avec du DPBS chaud et des photomicrographies à fluorescence ont été prises avec un grossissement de 20 fois à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé Leica Microsystems CMS GmbH (Leica Camera AG, Barnack, allemand).

Immunofluorescence

Pour évaluer la localisation mitochondriale, les cellules cultivées sur des lamelles ont été lavées avec du PBS froid et fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min. Ensuite, les cellules ont été perméabilisées avec du Triton X-100 0,5% pendant 20 min et bloquées avec du sérum de chèvre 5% pendant 30 min. Les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4°C et avec des anticorps secondaires pendant 1 h. Après trois lavages, les cellules ont été colorées avec du 4′-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et imagées avec un microscope confocal à balayage laser.

Mesure de l'ATP

De plus, la concentration intracellulaire d'ATP a été mesurée à l'aide d'un kit de test d'ATP suivant le protocole du fabricant. Les cellules ont été lysées dans le tampon de lyse par pipetage répété et centrifugées à 4 ° C et 13 000 g pendant 10 min. Les surnageants ont été utilisés pour l'analyse des niveaux d'ATP et les concentrations de protéines ont été déterminées par le test BCA. Un volume de cinquante microlitres de surnageant a été ajouté à 100 µl de solution de détection d'ATP, incubé à température ambiante pendant 5 minutes et mélangé immédiatement, et la luminescence a été déterminée à l'aide d'un luminomètre (Flex Station 3). La concentration d'ATP a été calculée selon une courbe standard et convertie en nmol/μg de protéine.

Western blot

L'expression des protéines a été évaluée par Western blot et quantifiée par densitométrie. Les cellules H9c2 traitées au Dox et Dox + Brev dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm ont été lysées avec le tampon de lyse RIPA. Prendre 5 mg de tissu et ajouter 10 ml de tampon de lyse. La méthode Bradford a été utilisée pour mesurer la concentration en protéines, en utilisant la BSA comme étalon. Des quantités équivalentes de protéines ont été mélangées avec du tampon de chargement (5X) et bouillies à 95 ° C pendant 5 min. Les protéines ont ensuite été résolues par électrophorèse sur des gels SDS-polyacrylamide 10% – 12% (SDS – PAGE) et transférées sur des membranes PVDF. Après blocage avec du lait 5% dans du TBST pendant 2 h à température ambiante, les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps spécifiques, tels que le GAPDH polyclonal de lapin. L'analyse WB de l'expression et de la phosphorylation des protéines a été réalisée à l'aide d'anticorps contre l'AMPK, Parkin, PINK1, Akt, PI3K, Tom20 et GAPDH a été utilisée comme contrôle interne. Des signaux spécifiques ont été visualisés à l'aide du système Bio-Rad gel doc (Bio-Rad Laboratories, Californie, États-Unis). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n = 3) et quantifié par analyse ImageJ.

Élevage

Des souris femelles C57BL/6 âgées de huit semaines (SiPeiFu, Pékin, Chine) ont été utilisées dans les expériences. Les animaux ont été hébergés dans des cages et selon un cycle de lumière de 12 h/12 h d'obscurité à une humidité de 50% et à 25°C ± 2°C. Les animaux ont eu libre accès à un régime alimentaire standard en granulés et à de l’eau. Le plasma a été obtenu par centrifugation à 200 g pendant 10 min à 4 °C et conservé à -80 °C avant extraction.

L'enquête est conforme aux Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis (NIH Publication No. 85-23, révisé 1985).

Protocoles expérimentaux sur animaux

Les souris ont été réparties au hasard dans six groupes de traitement, dont un groupe témoin, un groupe modèle (groupe Dox), des groupes Dox + Brev à trois doses et un groupe Dox + Dexra.

Pour imiter les schémas thérapeutiques humains, une dose cumulée de 12 mg/kg de Dox a été administrée via trois injections ip hebdomadaires (4 mg/kg aux jours 0, 7 et 14) sauf pour le groupe témoin.

Pour étudier l'effet de Brev in vivo, les souris ont été traitées avec Brev, suivie d'une injection ip quotidienne de 4,8 et 16 mg/kg de Brev pendant 3 semaines, et les souris du groupe de traitement Dox + Dexra ont reçu 12 mg/kg de Dexra par injection intrapéritonéale pendant 3 semaines en plus de Dox. traitement. (Alexandre et al., 2020). Brev et Dexra ont été traités après des injections de Dox. La survie a été surveillée quotidiennement et la fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie, 3 semaines après la première injection de Dox (Li et coll., 2018).

Le groupe témoin a reçu une injection du même volume de solution saline normale. Les souris ont été sacrifiées 1 semaine après l'administration de Dox.

Études sur les tumeurs

Des souris ont reçu une injection sous-cutanée de 1 × 10⁵ Cellules tumorales du sein 4T1. Une semaine après l'injection cellulaire, lorsque le diamètre moyen des tumeurs était supérieur à 2 mm, les souris ont été traitées avec du Dox ou de la bréviscapine comme décrit précédemment. La taille de la tumeur a été mesurée deux fois par semaine pendant 4 semaines maximum et les volumes tumoraux ont été calculés avec l'équation suivante : V = 4π/3×(L/2)2× (W/2), où V, L et W représentent le volume, la longueur et la largeur de la tumeur, respectivement.

¹⁸Imagerie TEP/CT au F-fluorodésoxyglucose

Des souris des groupes Dox et Breviscapine (à jeun pendant la nuit) ont été anesthésiées avec de l'isoflurane 2% et injectées avec environ 11 MBq / 0,2 ml de PET au fluorodésoxyglucose (FDG). via une veine de la queue, puis sont retournés dans leurs cages. Quarante minutes plus tard, les souris ont été à nouveau anesthésiées avec de l'isoflurane 2% et placées sur un lit stéréotaxique dans un microPET Focus 220 (société Siemens, Berlin, Allemagne). Une TEP statique de 20 minutes a ensuite été initiée. Ensuite, les souris ont été photographiées dans un microCAT II (société Siemens, Berlin, Allemagne) à une intensité de faisceau de rayons X de 180 mAs et une tension de tube à rayons X de 80 kVp pour un co-enregistrement anatomique avec les images TEP.

Les patients

Après plus de 4 heures de jeûne et en s'assurant que la glycémie était inférieure à 120 mg/dl, tous les patients ont reçu une administration intraveineuse de ¹⁸F-FDG (5,5 MBq/kg). Les scans TEP/CT ont été démarrés 60 minutes après l'injection à l'aide d'une biographie combinée TEP/CT (société Siemens, Berlin, Allemagne). Tous les scans ont été effectués dans un modèle tridimensionnel. Un scanner à faible dose a d'abord été obtenu pour la correction de l'atténuation et la corrélation anatomique. L'autorisation éthique est conforme au Guide du document d'approbation du comité d'éthique publié par l'hôpital affilié de l'Université de Qingdao (QDU-HEC-2022057).

Analyse de la fonction cardiaque et histopathologie

Le tissu cardiaque de souris de chaque groupe a été stocké dans du paraformaldéhyde 4%, incorporé dans de la cire de paraffine et coupé en série en sections de 4 mm. Les coupes de tissus ont été déparaffinées via immersion dans du xylène (3 fois, pendant 5 min chacune) et réhydratée à l'aide d'une série descendante d'alcools (alcool 100%, 90%, 85% et 75%, 5 min chacun). Les coupes ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine pour analyse histologique. Les échantillons de biopsie ont été colorés à l'aide de la coloration trichrome de Masson pour étudier tout changement morphologique et fibrotique dans le cœur. La coloration bleue représentait une accumulation de collagène. L'immunohistochimie a été réalisée à l'aide des kits de coloration Histone Simple (Nichirei, Tokyo, Japon) conformément aux instructions du fabricant. Les coupes ont été traitées pendant 15 minutes avec du 3% H2O2 dans du méthanol pour inactiver les peroxydases endogènes, puis ont été incubées à température ambiante pendant 1 heure avec les anticorps primaires IL-1, 1:100. L'ultrastructure a ensuite été observée avec un grossissement de 20 × à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée CMS GmbH de Leica Microsystems (Leica Camera AG, Barnack, Allemagne).

Mesure des niveaux de glucose

Les souris ont été maintenues avec un régime alimentaire normal. Le jour de l'expérimentation, les souris ont été mises à jeun pendant 6 heures (à partir de 8 heures du matin) et du sang a été collecté. via la veine caudale pour la mesure des niveaux de glucose.

Les cellules de cardiomyoblastes de rat H9c2 ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifugées et broyées par ultrasons, puis incubées dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 10 min. Après incubation, l'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Perkin Elmer, Massachusetts, États-Unis).

Dosage immuno-enzymatique

Les tissus de souris ont été lysés avec le tampon de lyse. Les échantillons ont été soniqués avec un homogénéisateur Qsonica en utilisant des impulsions de 30 Hz pendant 20 secondes, puis centrifugés à 12 000 g pendant 10 min. Le surnageant a été collecté, aliquoté dans des flacons de 200 µl et conservé à -80 °C. Les concentrations en protéines des échantillons ont été quantifiées par le test BCA. Les échantillons ont été analysés à l’aide de kits de dosage immuno-enzymatique pour le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6 conformément au protocole du fabricant. La densité optique a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques VICTOR Nivo™ (Perkin Elmer, Massachusetts, États-Unis).

Détermination des changements dans le métabolome de la souris

Les échantillons de sang ont été remis en suspension, incubés sur de la glace, centrifugés, dilués jusqu'à la concentration finale et centrifugés. Enfin, le surnageant a été injecté dans le système LC-MS/MS pour analyse. Les analyses UHPLC-MS/MS ont été réalisées à l'aide d'un système Vanquish UHPLC (Thermo Fisher, Massachusetts, États-Unis) couplé à un Orbitrap Q Exactive.^MT Spectromètre de masse HF (Thermo Fisher, Massachusetts, États-Unis). Les métabolites identifiés ont été annotés à l'aide de la base de données KEGG, de la base de données HMDB et de la base de données LIPID Maps. L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) ont été réalisées à l'aide de MetaX. Nous avons appliqué une analyse univariée (t-test) pour calculer la signification statistique (p-valeur). Métabolites avec un VIP>1, p une valeur <0,05 et un facteur de variation ≥2 ou ≤0,5 ont été considérés comme des métabolites différentiellement abondants.

Les anthracyclines augmentent la consommation d'oxygène du myocarde et diminuent le taux de production d'ATP

Il est intéressant de noter que cette compensation métabolique a augmenté les niveaux de ROS dans le myocarde, conduisant à un stress oxydatif plus élevé (Figure 2A). L'analyse du métabolisme énergétique O2K a montré que Dox augmentait la consommation d'oxygène du myocarde (Figure 2B) et conduit à une hyperpolarisation de la membrane mitochondriale (Figure 2C) (c'est également un signe de niveaux élevés de stress oxydatif mitochondrial et est souvent observé dans les modèles d'ischémie-reperfusion cardiaque). La coloration JC-1 a également montré que l'exposition au Dox provoquait une augmentation du potentiel membranaire (intensité de fluorescence rouge améliorée) dans quelques cellules survivantes (Figure 2D). Bien que des processus compensatoires tels qu’une consommation accrue d’oxygène et une oxydation des lipides se soient produits dans le cœur, le taux de production d’ATP dans le myocarde a malheureusement été considérablement réduit en réponse à la réduction du métabolisme du glucose (Figure 2E). La comparaison du taux de consommation d'oxygène et du taux de production d'ATP a montré que l'exposition au Dox entraînait la consommation d'une grande quantité d'oxygène par le myocarde mais la production d'une petite quantité seulement d'ATP (Figure 2F), augmentant considérablement la charge sur le cœur. Ce déficit de production d'énergie a provoqué une augmentation significative du niveau du récepteur énergétique AMPK dans le groupe Dox (Figure 2G). Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que le cœur présente un taux de consommation d’oxygène élevé et un faible taux de production d’ATP en réponse à une altération du métabolisme du glucose provoquée par les anthracyclines et que ce phénomène ne répond pas pleinement aux besoins énergétiques du myocarde mais conduit à un stress oxydatif excessif. On suppose donc qu’en réponse au déficit énergétique, l’oxydation des lipides dans le cœur augmente et que davantage de ROS s’accumulent, et que cette mauvaise voie de rétroaction pourrait être un facteur important de la CIVD.

Le nouvel agent cardioprotecteur breviscapine favorise le métabolisme cardiaque du glucose et inhibe la cardiomyopathie induite par Dox

Inspirés par les résultats susmentionnés, nous avons étudié l’effet protecteur du flavonoïde breviscapine, utilisé pour traiter les maladies cardiovasculaires, contre la progression de la CIVD d’un point de vue métabolique. Le protocole expérimental est présenté dans Figure 3A, et ¹⁸L’imagerie TEP/CT F-FDG a été réalisée sur des souris 1 semaine après la première injection de doxorubicine. Comme représenté sur la Figure 3B, l'absorption cardiaque était significativement plus élevée dans le groupe traité par la breviscapine que dans le groupe traité par le Dox seul, ce qui suggère que l'intervention par la breviscapine pourrait inverser la diminution du métabolisme cardiaque du glucose induite par le Dox et remodeler le métabolisme énergétique cardiaque. La fonction cardiaque et les changements pathologiques après le traitement par la breviscapine ont ensuite été examinés et le médicament clinique dexrazoxane (Dexra) a été utilisé comme contrôle positif. L'échocardiographie en Figure 3C ont montré que LVEF et LVFS dans le groupe Dox étaient significativement inférieurs à ceux du groupe témoin, et que LVESV et LVD étaient significativement supérieurs à ceux du groupe témoin. Ces résultats suggèrent que la fonction systolique ventriculaire gauche des souris a diminué après le traitement par Dox et que la lésion myocardique induite par Dox dans cette étude était similaire à une cardiomyopathie dilatée. Dox a réduit la fonction systolique, ce qui est similaire à ce qui a été rapporté précédemment (Venturini et coll., 1996; Soleil et coll., 2022). Toutes les fonctions ont été restaurées dans le cœur des animaux traités avec Brev et Dox par rapport à ceux des animaux traités uniquement avec la doxorubicine. Le cTnI est un biomarqueur des lésions myocardiques (Solaro et Solaro, 2020). La concentration de cTnI était significativement augmentée chez les souris traitées avec la doxorubicine seule par rapport à celles du groupe témoin, et différentes concentrations de Brev ont montré de meilleurs effets (Figure 3D). De plus, la coloration des tissus cardiaques pathologiques après différents traitements a montré que la structure du tissu cardiaque chez les souris du groupe témoin était normale. Contrairement à celles du groupe témoin, les souris du groupe Dox présentaient un grand nombre de lésions cardiaques, notamment une nécrose, un œdème intracellulaire, un trouble et une rupture myofibrillaires et une dégénérescence ondulée des fibres cardiaques. Il est intéressant de noter que le préconditionnement avec la breviscapine a permis d'éviter ce type de lésion, d'atténuer l'accumulation excessive de lipides cardiaques et de restaurer l'homéostasie myocardique (Figure 3F). La coloration Masson du myocarde a montré que la fibrose interstitielle était significativement augmentée après le traitement Dox et que l'intervention Brev réduisait le degré de fibrose cardiaque (Figure 3E). Les données d'échographie cardiaque ont montré que les LVESV et LVID étaient significativement plus élevés dans le groupe Dox que dans le groupe témoin, suggérant un élargissement du diamètre de la cavité ventriculaire et que le traitement par la bréviscapine pourrait atténuer considérablement ces changements. Ces résultats suggèrent que la breviscapine peut remodeler le métabolisme cardiaque, augmenter l'absorption cardiaque du glucose, réduire la stéatose cardiaque et atténuer le dysfonctionnement cardiaque induit par la doxorubicine et les modifications de la morphologie du myocarde.

La breviscapine remodèle le métabolisme cardiaque du glucose et des lipides en régulant les taux sériques périphériques et l'expression de l'AKT myocardique

Ensuite, nous avons étudié comment la breviscapine régule l’équilibre du métabolisme des sucres et des graisses. Comme représenté sur la Figure 4E, le niveau de sérotonine dans le sérum périphérique chez les souris traitées par la bréviscapine a été considérablement augmenté par rapport à celui des souris traitées par Dox, et le degré de diminution a montré une relation linéaire avec la dose de bréviscapine, une diminution de plus de 95% étant observé dans le groupe recevant la dose élevée. La sérotonine (5-HT) est une monoamine qui remplit diverses fonctions dans les systèmes neuronaux et non neuronaux (Okaty et coll., 2019). Dans le système nerveux central, la 5-HT agit comme un neurotransmetteur qui régule l'humeur et le comportement alimentaire (Berger et coll., 2009). Des études récentes ont montré que la 5-HT périphérique joue un rôle important dans la régulation métabolique des tissus périphériques en inhibant la thermogenèse adaptative dans le tissu adipeux brun. L'inhibition de la synthèse de 5-HT réduit la prise de poids et améliore le dysfonctionnement métabolique dans un modèle murin d'obésité induite par l'alimentation (Zemdegs et coll., 2016; Xia et coll., 2021). Des études d'association à l'échelle du génome ont également révélé un lien génétique entre le système sérotoninergique et l'obésité. La sérotonine a deux effets différents sur le métabolisme du glucose : elle induit directement la sécrétion d'insuline dans les cellules B pancréatiques, abaissant ainsi la glycémie ; et il inhibe l'absorption du glucose sanguin par les tissus autres que le foie et les muscles squelettiques, augmentant ainsi le taux de sucre dans le sang (Watanabe et coll., 2011; Carmean et coll., 2019; Yabut et coll., 2019). Des études ont montré que le traitement à la sérotonine peut entraîner une augmentation soudaine et importante de la glycémie, mais la manière dont la sérotonine inhibe l'absorption tissulaire du glucose sanguin reste floue. Nos résultats expérimentaux ont montré qu'après un traitement par la bréviscapine, les taux périphériques de sérotonine diminuaient fortement, correspondant à une augmentation de l'apport cardiaque en glucose (Figure 4E), tandis que l'apport hépatique en glucose n'a pas changé de manière significative (Figure supplémentaire S2) et les taux de glycémie à jeun (FBG) ont diminué (Figure 4A). Dans le groupe breviscapine, une supplémentation supplémentaire en 5-HT a augmenté le taux de sérotonine chez la souris et diminué l'absorption cardiaque du glucose (Figure 4B). Pour analyser plus en détail la façon dont la sérotonine régule le métabolisme des cardiomyocytes, nous avons ajouté du 5-HT supplémentaire pour augmenter les niveaux de sérotonine chez les souris modèles de lésions myocardiques induites par Dox, puis avons collecté les cœurs des souris pour une analyse du transcriptome. Les résultats ont montré que l'oxydation des acides gras dans le groupe traité avec Dox et 5-HT était significativement plus élevée que celle du groupe Dox seul (Figure supplémentaire S3). Nous avons ensuite analysé les changements dans la voie PI3K-protéine kinase B (Akt/PKB), un régulateur important du métabolisme du glucose myocardique qui joue un rôle important dans la régulation de l'absorption du glucose ; favoriser la division cellulaire, la prolifération et la survie ; et inhiber l'apoptose. Les résultats ont montré que l’ajout de 5-HT inhibait directement l’expression génique d’Akt mais ne modifiait pas de manière significative le niveau de la sous-unité catalytique PI3K ou la sous-unité régulatrice (Figure 4C). La perte d'AKT réduit la capacité des cardiomyocytes à métaboliser le glucose. Ces résultats suggèrent que la breviscapine soulage l'effet inhibiteur de la sérotonine sur l'absorption tissulaire du glucose en réduisant considérablement le niveau de sérotonine et assure l'absorption du glucose du sang dans des conditions pathologiques, révélant la possibilité que l'organisme puisse participer à la régulation du métabolisme cardiaque. remodelage grâce aux neurotransmetteurs. Plus important encore, la breviscapine, en tant que médicament cardiovasculaire couramment utilisé en Chine, peut réduire les taux de sérotonine périphérique de plus de 90% et a un effet plus robuste que la fluoxétine, un inhibiteur classique de la recapture de la sérotonine, dans le traitement de l'hypertrophie myocardique et de l'insuffisance cardiaque induite par le métabolisme du glucose myocardique. et le diabète, représentant un nouvel agent sûr pour le traitement de la cardiotoxicité induite par Dox. Des études épidémiologiques ont également montré que le diabète augmente le risque de cardiotoxicité induite par Dox ; ainsi, cette étude fournit une stratégie de traitement potentielle pour les patients atteints de diabète et de cancer (Chang et coll., 2021).

Sur la base de ces résultats, nous avons étudié comment la breviscapine régule le glucose. Utilisation par le cœur. Les résultats ont montré que l’expression de la protéine PI3K chez les souris exposées au Dox était significativement diminuée et que le niveau d’expression de la protéine PI3K dans le tissu cardiaque était significativement augmenté après l’intervention par la breviscapine. Il est intéressant de noter que l'expression de l'AKT a été maintenue à de faibles niveaux dans les groupes témoins et exposés au Dox, et une augmentation significative de l'expression de l'AKT a été observée après le traitement par la bréviscapine (Figure 4D). Des études antérieures ont montré que l'AKT stimule le métabolisme du glucose dans les cellules, convertissant le glucose en D-glucose 6-phosphate via hexokinase pour la glycolyse ou la polymérisation en glycogène. Nos résultats ont montré qu'après que la breviscapine ait favorisé l'expression de l'AKT myocardique, les taux de D-glucose 6-phosphate et d'acide α-cétoglutarique liés au métabolisme du glucose étaient significativement augmentés (Figure 4F,G), suggérant que la breviscapine améliore la capacité du myocarde à utiliser le glucose comme source d'énergie via l'AKT et favorise le catabolisme du glucose. Des études antérieures ont rapporté qu'une expression accrue de PI3K-Akt peut favoriser l'utilisation du sucre dans les tissus périphériques, réduire la résistance à l'insuline, améliorer l'approvisionnement en énergie cardiaque et prévenir l'insuffisance cardiaque, tandis que l'inhibition de la voie PI3K-Akt affecte les activités physiologiques des cellules cardiaques (Zhu et coll., 2013). Ces résultats suggèrent que la breviscapine améliore la résistance aux lésions myocardiques induites par Dox en modulant l'activation de la voie PI3K-Akt. Ces résultats suggèrent que la breviscapine régule la glycémie en inhibant la sérotonine, bloque la restriction de l'utilisation du glucose dans le myocarde et favorise le métabolisme du glucose dans le myocarde en activant la voie PI3K-Akt. Par conséquent, la sérotonine peut être une cible importante pour réguler le métabolisme cardiaque des glycolipides. Nous avons ensuite analysé les changements dans la fonction cardiaque et l'homéostasie suite au remodelage du métabolisme des glycolipides myocardiques. Par rapport à celle du groupe modèle Dox, la production myocardique d'ATP dans le groupe traité par la breviscapine était significativement augmentée (Figure 5A), tandis que les niveaux de ROS et de MDA, un métabolite de la FAO, ont été considérablement diminués (Figures 5B,E). L'analyse du métabolisme énergétique O2K a montré que la bréviscapine inhibait l'augmentation spectaculaire de la consommation cardiaque d'oxygène provoquée par l'exposition au Dox (Figure 5C), diminue significativement le rapport production d’ATP/consommation d’oxygène (Figure 5D), et a normalisé le potentiel de membrane mitochondriale (Figure supplémentaire S4). Ceci suggère que le traitement par la bréviscapine augmente la capacité du myocarde à utiliser le glucose à haute efficacité énergétique comme source d'énergie ; améliore l'efficacité de la production d'ATP ; et réduit la charge cardiaque, le stress oxydatif et la consommation d'oxygène du myocarde. En conclusion, la breviscapine peut briser efficacement le cercle vicieux d'un taux de consommation élevé d'oxygène et d'une combustion inadéquate des lipides dans le cœur provoquée par l'exposition au Dox en régulant la boucle AKT sérotonine-glycémie-myocardique, en remodelant le métabolisme énergétique du myocarde, en augmentant l'utilisation du glucose et en réduisant la FAO. (Figure 5F), empêchant le développement ultérieur du DIC.

La breviscapine élimine les dommages mitochondriaux et rétablit l'homéostasie myocardique après le traitement par Dox via la voie de signalisation PINK1/Parkin

Bien que les hypothèses concernant les mécanismes de la CIVD aient varié au cours des dernières décennies, les principales caractéristiques de la CIVD sont un déséquilibre rédox et une altération de la fonction mitochondriale. Les résultats précédemment empêchés ont amélioré l'hypothèse du développement de la CIVD du point de vue du rapport énergétique cardiaque et de l'efficacité de la production d'énergie, mais soulèvent une question clé, à savoir comment la breviscapine atteint une production d'énergie efficace et une homéostasie microenvironnementale cardiaque en optimisant le réseau métabolique dans le cœur après la mitochondrie. blessure. Ainsi, nous avons cherché à répondre à cette question. La voie de signalisation putative kinase1 PINK1/Parkin induite par Pten est l'une des principales voies médiées par l'autophagie mitochondriale et joue un rôle important dans le maintien du métabolisme énergétique des cardiomyocytes (Dewanjee et coll., 2021). Lorsque les mitochondries des cellules myocardiques sont endommagées, PINK1, en tant que « sentinelle » du système de contrôle de la qualité des mitochondries, s'accumule dans la membrane externe des mitochondries et collecte et phosphoryle la Parkine (Poole et Macleod, 2021). La Parkin activée ubiquitine les mitochondries endommagées, qui fusionnent ensuite avec les lysosomes pour compléter la dégradation. Une autophagie mitochondriale améliorée médiée par la voie de signalisation PINK1/Parkin peut maintenir l'homéostasie mitochondriale dans les cardiomyocytes et ralentir la progression des maladies cardiaques (Dorn, 2016).

Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que la breviscapine améliore l’autophagie mitochondriale via la voie PINK1/Parkin et maintient l’homéostasie mitochondriale dans les cardiomyocytes. WB a montré que par rapport à celui du groupe Dox, le niveau d'expression totale de la protéine PINK1/Parkin dans le groupe de traitement par la breviscapine était significativement augmenté (Figure 6A), et le niveau de phosphorylation correspondant a également été significativement augmenté (Figure 6B). Dans le groupe de traitement Dox, l'expression de la protéine PINK1/Parkin a montré une tendance à la baisse et la phosphorylation des protéines a été significativement diminuée, tandis que le niveau de la protéine membranaire mitochondriale Tom20 a augmenté, ce qui suggère que bien que Dox ait induit des dommages mitochondriaux, il a inhibé l'élimination rapide des dommages mitochondriaux. mitochondries. Un grand nombre de mitochondries cassées et endommagées ont été observées dans le groupe Dox (flèche rouge, Figure 6D), tandis qu'une grande quantité d'autophagie mitochondriale enveloppée de lysosomal a été observée dans le groupe Brev (flèche bleue). Lorsque Dox et Brev ont été appliqués simultanément, la crête mitochondriale était évidente, la morphologie mitochondriale était normale et la structure membranaire était intacte. Lors de la coloration avec MitoTracker, l'intensité de fluorescence la plus élevée a été trouvée dans le groupe Dox (Figure 6C), indiquant qu'il y avait significativement plus de mitochondries dans le groupe Dox que dans les groupes témoin et Brev. De plus, les niveaux des protéines antioxydantes NADH et SOD ont augmenté de manière significative après le traitement par Brev (Figure supplémentaire S5). La phosphorylation du récepteur énergétique AMPK était significativement réduite dans le groupe de traitement Brev par rapport au groupe Dox, tandis que les centres de contrôle de la croissance cellulaire étaient activés (Figure 6E). Ces résultats indiquent que l'exposition au Dox provoque des lésions myocardiques, une accumulation mitochondriale et un déséquilibre de l'homéostasie, ce qui explique dans une certaine mesure pourquoi l'efficacité de la production d'énergie cardiaque est réduite et le stress oxydatif est augmenté après l'administration de Dox. La breviscapine peut favoriser l'autophagie mitochondriale, éliminer les mitochondries endommagées et restaurer l'homéostasie myocardique, assurant ainsi l'équilibre dynamique entre la production cardiaque d'ATP et le stress oxydatif.

Lorsque cet effet de la bréviscapine était bloqué par Mdivi-1, le taux de ROS dans les cardiomyocytes était significativement augmenté (Figure 6F), tandis que la production d'ATP était considérablement diminuée (Figure 6G). De plus, le taux de survie des cardiomyocytes était diminué (Figure supplémentaire S6), et l'effet réparateur de la bréviscapine sur les cardiomyocytes a été inhibé. Lorsque Dox et Mdivi-1 ont été combinés, la production d'ATP et le taux de survie des cellules myocardiques ont été encore réduits, le niveau de ROS a augmenté et les lésions myocardiques ont été aggravées. Ces résultats suggèrent que l'autophagie mitochondriale joue un rôle clé dans les lésions des cardiomyocytes induites par Dox. Le remodelage du réseau métabolique du cœur ne peut à lui seul compenser complètement le dysfonctionnement provoqué par une lésion mitochondriale, et l'effet protecteur myocardique de la breviscapine dépend de la régulation du métabolisme du glucose et des lipides et de l'activation de l'autophagie mitochondriale. C’est peut-être aussi la raison pour laquelle la régulation du réseau métabolique cardiaque n’a pas été prise en compte dans l’hypothèse du développement d’une CIVD. Il est suggéré que la prévention de la progression de la maladie et la restauration de la fonction cardiaque soient tout aussi importantes dans le traitement des symptômes de dysfonctionnement cardiaque et d'insuffisance cardiaque provoqués par Dox, ce qui est plus bénéfique pour le pronostic et la qualité de vie des patients.

Les auteurs remercient le W-SS, l'Institut du cancer de l'hôpital affilié de l'Université de Qingdao, en Chine, pour la préparation du projet original et la conservation des données.