Tác dụng bảo vệ của Tisochrysis lutea đối với hội chứng khô mắt thông qua ức chế NF-κB

Nguyên vật liệu

Vật liệu in vivo/in vitro

T. lutea được lấy từ Microalgae Ask us Corp. (Gangneung, Korea). Scopolamine, fluorescein, hematoxylin và eosin (H&E) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) để thí nghiệm trên động vật. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM): F12, dung dịch muối đệm phốt phát (DPBS) của Dulbecco, huyết thanh bò bào thai (FBS) và dung dịch trypsin–EDTA 0,25% được lấy từ Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Dung dịch kháng sinh, bao gồm 10.000 U/mL penicillin và 10.000 μg/mL streptomycin, được mua từ Hyclone Laboratories Inc. (South Logan, UT, Hoa Kỳ). TNF-α tái tổ hợp của con người được lấy từ các hệ thống R&D (Minneapolis, MN, USA). Các kháng thể chính bao gồm kinase được điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK), kinase chống c-jun N-terminal (JNK), anti-p38, anti-α-tubulin và anti-β-actin được mua từ Công nghệ sinh học Santa Cruz ( Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ). Các kháng thể chính khác và kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase (HRP) được lấy từ Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, USA). Các hóa chất bao gồm 3–4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Vật liệu phân tích hóa học

PUFA được xác định bằng cách sử dụng dung dịch chứa 37 chất tiêu chuẩn PUFA được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Axit valeric được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) để sử dụng làm chất chuẩn nội. Các dung môi, bao gồm dung dịch boron triflorua metanol, N-hexan, Na₂VÌ THẾ₄, CH₃Cl, MeOH và NaCl, được sử dụng để chiết xuất PUFA từ T. lutea được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Tuyên bố đạo đức

Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC) của Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (KIST): KIST số 2020-002, Viện Gangneung và tuân theo tuyên bố của Hiệp hội Nghiên cứu Thị giác và Nhãn khoa về Sử dụng động vật trong nghiên cứu nhãn khoa và thị giác. Ngoài ra, chúng tôi tuân theo các khuyến nghị về Nghiên cứu Động vật: Báo cáo Thí nghiệm In Vivo (ARRIVE). Tất cả các thủ tục được thực hiện tuân thủ các quy định và hướng dẫn hiện hành.

Thí nghiệm trên động vật và cảm ứng mô hình DES

Chuột được nhốt trong phòng động vật có máy lạnh và duy trì ở nhiệt độ 22 ° C ± 2 ° C, độ ẩm 50% ± 10% và chu kỳ sinh học 12 giờ sáng/12 giờ tối. Thức ăn và nước được cung cấp tự do. Chuột được làm quen với khí hậu trong một tuần trước khi được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm gồm bảy con chuột BALB / c đực 6 tuần tuổi (Orientbio, Gyunggi-do, Hàn Quốc). DES được gây ra thực nghiệm trên chuột hai lần mỗi ngày thông qua tiêm trong phúc mạc 200 μL (2,5 mg/mL) scopolamine pha loãng trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). T. lutea được dùng bằng đường uống cho các nhóm chuột hàng ngày ở nồng độ 0 (kiểm soát phương tiện), 100, 150 hoặc 300 mg/kg trong 200 μL nước cất. Nhóm đối chứng nhận PBS không có scopolamine. Khi T. lutea được dùng bằng đường uống, 200 μL nước cất được sử dụng trong nhóm đối chứng và nhóm DES. Việc sản xuất nước mắt được định lượng sau hai tuần bằng cách sử dụng que thử Schirmer tiêu chuẩn đặt ở 1/3 dưới của mí mắt thái dương trước khi nhắm mắt lại trong 1 phút. Sau đó, dải này được lấy ra và đo chiều dài của điểm ướt tính bằng milimét để xác định giá trị thử nghiệm của Schirmer. Nhuộm bề mặt giác mạc được sử dụng để xác định mức độ thay đổi bề mặt giác mạc. Bề mặt giác mạc được quan sát và ghi điểm sau khi tiêm một giọt fluorescein 3% vào kết mạc bên dưới. Nhuộm giác mạc được đánh giá một cách mù quáng. Chuột đã được tiêu hủy do trật khớp cổ tử cung. Giác mạc được lấy ra bằng cách búng mi chuột và dùng kẹp cắt dây thần kinh thị giác ra khỏi nhãn cầu và lấy giác mạc ra. Thấu kính tinh thể được lấy ra từ bên trong giác mạc và được bảo quản ở -80 ° C. Tuyến lệ được cắt bỏ khỏi hàm dưới của chuột bằng kẹp và lớp biểu bì của vùng kéo được cắt đi để lộ nửa dưới của khuôn mặt. Tuyến lệ gần hàm dưới được cố định và cắt bỏ sau đó bảo quản ở nhiệt độ -80°C, tránh ánh sáng.

mô học

Các mô biểu bì giác mạc và tuyến lệ được thu thập và cố định trong formaldehyde 10%, sau đó được xử lý để nhúng và cắt parafin. Các phần được nhuộm bằng H&E và được kiểm tra ở độ phóng đại 40 × bằng kính hiển vi (TE-2000U, Nikon, Tokyo, Nhật Bản). độ dày biểu mô giác mạc trung tâm được xác định bằng cách chia mỗi giác mạc thành năm phần.

Nhuộm DAB để phân tích hóa mô miễn dịch (IHC)

Các mô từ tuyến lệ của chuột BALB/c được lấy và cố định bằng formaldehyde 10%. Các mô tuyến lệ cố định được nhúng parafin, cắt nhỏ (5 μm) và parafin được loại bỏ ba lần trong 3 phút bằng xylene (Junsei, Tokyo, Nhật Bản). Các phần được hydrat hóa trong 1 phút trong ethanol 100, 95, 70 và 50%. Kháng nguyên tuyến lệ được chiết xuất bằng lò vi sóng với đệm TRIS–EDTA (pH 9,0). Sau khi bôi hydro peroxide 3% vào các phiến mô trong 15 phút, các phần này được chặn bằng 2% BSA trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các phần được xử lý qua đêm ở 4 ° C bằng CD45 (Bio-RAD, MCA 1258GT, pha loãng 1:100). Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được xử lý trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng bằng IgG-HRP chống thỏ (Công nghệ sinh học Santa Cruz, Dallas, TX, Hoa Kỳ, SC-2357, pha loãng 1:100) và nhuộm màu trong 1 phút với 3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA, Hoa Kỳ). Các phiến kính được nhuộm trong 30 giây bằng hematoxylin và rửa sạch bằng nước máy. Sau đó, các lát cắt này được phủ lên và gắn bằng Permount™ Mounting Medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tất cả các slide được kiểm tra và chụp ảnh bằng kính hiển vi ánh sáng (Olympus, CX43, Olympus Optical Co., Tokyo, Nhật Bản). Phần mềm ImageJ (phiên bản 1.53, Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD, Hoa Kỳ)⁴⁸ được sử dụng để thực hiện phân tích dữ liệu định lượng.

Nuôi cấy tế bào ARPE-19

Các tế bào ARPE-19 biểu mô võng mạc ở người (Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ, ATCC, Manassas, VA, Hoa Kỳ) được nuôi cấy trên môi trường DMEM / F-12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) được bổ sung 10% FBS (Phòng thí nghiệm HyClone, Logan, UT , Hoa Kỳ) và 1% penicillin/streptomycin (Phòng thí nghiệm HyClone). Tế bào được gieo hạt với mật độ 2×10⁵ mỗi giếng trong các đĩa 6 giếng và nuôi cấy để tạo ra phản ứng viêm và nội chất.

Khả năng di động

Ảnh hưởng của T. lutea về khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT như nghiên cứu đã mô tả trước đây⁴⁹ nhưng với những sửa đổi nhỏ. Tế bào được cấy vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 1,5 × 10⁴ tế bào/giếng và ủ trong 24 giờ. Các tế bào sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của T. lutea và ủ thêm 24h nữa. Phần nổi phía trên của mỗi giếng được thay thế bằng môi trường tăng trưởng mới chứa 0,5 mg/mL MTT và ủ trong 1 giờ. Chất nổi phía trên được loại bỏ và cặn formazan tạo ra được hòa tan trong 200 µL dimethyl sulfoxide. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm. Khả năng tồn tại của tế bào được tính toán tương đối theo tỷ lệ phần trăm so với các nhóm đối chứng âm tính.

Phân tích Western blot

Phương pháp Western blot đã được tiến hành để xác định các con đường truyền tín hiệu tế bào làm cơ sở cho tác dụng chống viêm của T. lutea như đã mô tả nghiên cứu trước đây⁴⁹, nhưng với những sửa đổi nhỏ. Các tế bào ARPE-19 hợp lưu bị bỏ đói trong DMEM: F12 chứa kháng sinh 1% FBS và 1% trong 24 giờ. Sau đó tế bào được xử lý bằng T. lutea (50 và 100 μg/mL) trong 2 giờ và sau đó được kích thích bằng 20 ng/mL TNF-α trong 15 phút. Các tế bào được rửa ba lần bằng DPBS lạnh như băng và sau đó được lọc trong dung dịch đệm chiết protein (Công nghệ sinh học iNtRON, Kyunggi-do, Hàn Quốc) được bổ sung một loại cocktail gồm các chất ức chế protease và phosphatase. Chất nổi phía trên của lysate thu được bằng cách ly tâm (14.000 ×g, 30 phút, 4 ° C) và nồng độ protein của chúng được ước tính bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein DCTM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Lượng bằng nhau (15–25 μg) protein tế bào được phân tách bằng SDS-PAGE và chuyển vào màng PVDF. Màng được ủ với albumin huyết thanh bò 5% hoặc sữa gầy, sau đó được ủ với các kháng thể chính pha loãng 1:2000 (chống phopho-ERK, chống ERK, chống phospho-JNK, chống JNK, chống phospho-p38 , anti-p38, anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho-IκB-α, anti-IκB-α, anti-phospho-p65, anti-p65, anti-α-tubulin và anti-β-action ) ở 4°C và 12 giờ. Sau đó, các màng này được rửa bằng TBS-T và xử lý trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng bằng kháng thể thứ cấp liên hợp HRP chống thỏ ở độ pha loãng 1:10.000. Các dải protein được phát hiện bằng cách sử dụng Chất nền có độ nhạy tối đa SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Khoa học) và hiển thị trong hệ thống tài liệu gel iBright CL1000 (Thermo Fisher Khoa học). Mật độ của từng đốm protein được xác định bằng phần mềm Image J (phiên bản 1.53, NIH)⁴⁸.

Tổng số chiết xuất PUFA từ T. lutea

Tổng số PUFA được chiết xuất từ T. lutea sử dụng kỹ thuật Folch⁵⁰. Tóm lại, 100 mg mẫu được cho vào lọ chứa 5 mL CH₃Dung dịch Cl:MeOH (2:1, v/v) và siêu âm trong 15 phút. Việc đình chỉ được làm rõ bằng cách ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng / phút trong 5 phút. Na₂VÌ THẾ₄ được thêm vào phần nổi phía trên, sau đó được lọc để loại bỏ lượng nước còn lại. Bước này được lặp lại hai lần nữa. Dung dịch này sau đó được cô đặc trong khí nitơ để thu được lipit tảo tinh khiết.

Methyl hóa axit béo

Quá trình methyl hóa axit béo được thực hiện để chuẩn bị mẫu lipid cho phân tích sắc ký khí (GC). Vật liệu đã chiết được bổ sung vào lọ 10 mL, sau đó là 1 mL hỗn hợp NaOH:MeOH 0,5 N. Dung dịch này chứa 400 μg/mL sợi bên trong (axit valeric). Hỗn hợp được lắc trong 30 giây và sau đó được ủ trong 20 phút ở 80 ° C. Hỗn hợp này sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 2 mL boron triflorua:MeOH vào, sau đó khuấy trong 30 giây. Hỗn hợp này được ủ trong 20 phút ở 80 ° C sau đó làm lạnh trong 10 phút. Một thể tích 2 mL NaCl siêu bão hòa đã được thêm vào để tạo ra sự tách pha và thu thập axit béo. Tiếp theo, 1,5 mL N-hexane được thêm vào và hỗn hợp được khuấy trộn trong 30 giây trước khi làm nguội ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các lớp được tách ra và chất lỏng nổi phía trên được loại bỏ khỏi hỗn hợp và nước được loại bỏ hoàn toàn bằng dung dịch Na bão hòa.₂VÌ THẾ₄ lọc.

Xác định axit béo

Các metyl este của axit béo (FAME) đã được kiểm tra bằng GC được trang bị máy dò ion hóa ngọn lửa (FID; Agilent 7890A, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA). Các mẫu (1 µL) được bơm vào cột HP-88 của GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) (100 m × 250 μm ID, màng 0,2 μm). Phân tích GC được thực hiện như sau: ban đầu các mẫu được giữ ở 140°C trong 5 phút, sau đó nhiệt độ được tăng lên ở 4°C/phút đến 240°C trong 15 phút. Tốc độ dòng của cột được cố định ở mức 1 mL/phút. Khí nitơ được sử dụng làm khí mang cho phân tích, FID được đặt ở 280°C và tỷ lệ phân chia là 30:1. FAME được xác định bằng cách so sánh chúng với các tiêu chuẩn đã biết. Mỗi mẫu được đo bằng phân tích GC ba lần.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được phân tích thống kê bằng cách sử dụng ANOVA một chiều với phân tích hậu kỳ của Tukey bằng SPSS phiên bản 18.0 (IBM Co., Armonk, NY, USA). Ít nhất ba lần lặp lại độc lập đã được thực hiện cho mỗi thí nghiệm.