ผลการป้องกันของ Tisochrysis lutea ต่อโรคตาแห้งผ่านการยับยั้ง NF-κB

วัสดุ

วัสดุในสิ่งมีชีวิต/ในหลอดทดลอง

ต. ลูเทีย ได้มาจาก Microalgae ask us Corp. (คังนึง ประเทศเกาหลี) ซื้อ Scopolamine, fluorescein และ hematoxylin และ eosin (H&E) จาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) เพื่อการทดลองในสัตว์ Modified Eagle's Medium (DMEM): F12 ของ Dulbecco, น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (DPBS), ซีรั่มของวัวในครรภ์ (FBS) ของ Dulbecco และสารละลายทริปซิน – EDTA 0.25% ได้มาจาก Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) ซื้อสารละลายยาปฏิชีวนะซึ่งประกอบด้วยเพนิซิลลิน 10, 000 U / mL และสเตรปโตมัยซิน 10, 000 μg / mL จาก Hyclone Laboratories Inc. (South Logan, UT, USA) TNF-α ของมนุษย์รีคอมบิแนนท์ได้มาจากระบบ R&D (Minneapolis, MN, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิซึ่งรวมถึงไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK), ไคเนสที่ปลาย N ของ anti-c-jun (JNK), แอนติ-p38, แอนติ-ทูบูลิน และแอนติ-β-แอคตินถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ ( ซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีปฐมภูมิอื่น ๆ และมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HRP) - แอนติบอดีทุติยภูมิที่ผันแปรได้มาจาก Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, USA) ซื้อสารเคมีรวมถึง 3–4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) จาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)

วัสดุวิเคราะห์ทางเคมี

PUFA ถูกระบุโดยใช้สารละลายที่มีสารมาตรฐาน PUFA 37 ชนิด ซึ่งซื้อจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) กรดวาเลริกได้มาจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) เพื่อใช้เป็นมาตรฐานภายใน ตัวทำละลาย รวมถึงสารละลายโบรอน ไตรฟลูออไรด์ เมทานอล n-เฮกเซน, นา₂ดังนั้น₄, ช₃Cl, MeOH และ NaCl ใช้ในการสกัด PUFA ต. ลูเทีย ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่, สหรัฐอเมริกา)

คำแถลงทางจริยธรรม

งานวิจัยนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน (IACUC) ของสถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งเกาหลี (KIST): KIST หมายเลข 2020-002, สถาบัน Gangneung และปฏิบัติตามคำแถลงของ Association for Research in Vision and Ophthalmology เกี่ยวกับ การใช้สัตว์ในการวิจัยจักษุและการมองเห็น นอกจากนี้ เรายังปฏิบัติตามคำแนะนำในการวิจัยในสัตว์: การรายงานการทดลองในสัตว์ทดลอง (ARRIVE) ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการตามกฎระเบียบและแนวทางที่เกี่ยวข้อง

การทดลองกับสัตว์และการเหนี่ยวนำแบบจำลอง DES

หนูถูกเลี้ยงไว้ในห้องสำหรับสัตว์ปรับอากาศและคงไว้ที่อุณหภูมิ 22 °C ± 2 °C, ความชื้น 50% ± 10% และวงจรนาฬิการอบโลกมืด 12 ชั่วโมง/12 ชั่วโมง มีการจัดหาอาหารและน้ำให้อย่างไม่จำกัด หนูถูกปรับให้ชินกับสภาพแวดล้อมเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ก่อนที่จะถูกสุ่มแบ่งออกเป็นห้ากลุ่มของหนู BALB/c ตัวผู้อายุ 6 สัปดาห์เจ็ดตัว (Orientbio, Gyunggi-do, Korea) DES ถูกชักนำให้เกิดการทดลองในหนูวันละสองครั้งโดยการฉีดสโคโพลามีน 200 μL (2.5 มก. / มล.) ในช่องท้องเจือจางในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ต. ลูเทีย ถูกบริหารให้ทางปากแก่กลุ่มหนูทุกวันที่ความเข้มข้น 0 (กลุ่มควบคุมพาหะนำ), 100, 150 หรือ 300 มก./กก. ในน้ำกลั่น 200 ไมโครลิตร กลุ่มควบคุมได้รับ PBS โดยไม่มีสโคโพลามีน เมื่อไร ต. ลูเทีย ถูกบริหารให้ทางปาก โดยใช้น้ำกลั่น 200 ไมโครลิตรในกลุ่มควบคุมและกลุ่ม DES วัดปริมาณการผลิตน้ำตาหลังจากผ่านไปสองสัปดาห์โดยใช้แถบทดสอบมาตรฐานของ Schirmer ที่วางไว้ที่หนึ่งในสามส่วนล่างของเปลือกตาชั่วคราว ก่อนที่จะปิดตาเป็นเวลา 1 นาที จากนั้นนำแถบออกและวัดความยาวของจุดเปียกในหน่วยมิลลิเมตรเพื่อกำหนดค่าทดสอบของ Schirmer การย้อมสีพื้นผิวกระจกตาถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดขอบเขตของการเปลี่ยนแปลงพื้นผิวกระจกตา พื้นผิวกระจกตาถูกสังเกตและให้คะแนนหลังจากฉีดฟลูออเรสซีน 3% หนึ่งหยดเข้าไปในเยื่อบุตาด้านข้างด้านล่าง การย้อมสีกระจกตาได้รับการประเมินแบบสุ่มสี่สุ่มห้า หนูถูกการุณยฆาตโดยการเคลื่อนที่ของปากมดลูก กระจกตาถูกเอาออกโดยการสะบัดเปลือกตาของเมาส์และใช้คีมตัดเส้นประสาทตาออกจากลูกตาแล้วเอากระจกตาออก เลนส์คริสตัลไลน์ถูกถอดออกจากภายในกระจกตาและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 80 °C ต่อมน้ำตาถูกเอาออกจากกรามล่างของหนูโดยใช้คีม และหนังกำพร้าของบริเวณที่ดึงออกถูกตัดออกเพื่อเผยให้เห็นครึ่งล่างของใบหน้า ต่อมน้ำตาใกล้กับขากรรไกรล่างได้รับการยึดและนำออก จากนั้นเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 80 °C โดยป้องกันไม่ให้ถูกแสง

มิญชวิทยา

ผิวหนังชั้นนอกของกระจกตาและเนื้อเยื่อของต่อมน้ำตาถูกรวบรวมและแก้ไขในฟอร์มาลดีไฮด์ 10% ตามด้วยการประมวลผลสำหรับการฝังพาราฟินและการแบ่งส่วน ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วย H&E และตรวจที่กำลังขยาย 40 × โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ (TE-2000U, Nikon, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ความหนาของเยื่อบุผิวกระจกตาส่วนกลางถูกกำหนดโดยการแบ่งกระจกตาแต่ละส่วนออกเป็นห้าส่วน

การย้อมสี DAB สำหรับการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC)

นำเนื้อเยื่อจากต่อมน้ำตาของหนู BALB/c มาแก้ไขด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 10% เนื้อเยื่อของต่อมน้ำตาคงที่ถูกฝังพาราฟิน, แบ่งส่วน (5 μm) และพาราฟินถูกเอาออกสามครั้งเป็นเวลา 3 นาทีโดยใช้ไซลีน (จุนเซ, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ส่วนต่างๆ ถูกทำให้ไฮเดรตเป็นเวลา 1 นาทีในเอธานอล 100, 95, 70 และ 50% แอนติเจนของต่อมน้ำตาถูกสกัดด้วยไมโครเวฟด้วยบัฟเฟอร์ TRIS–EDTA (pH 9.0) หลังจากใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% กับสไลด์เนื้อเยื่อเป็นเวลา 15 นาที ส่วนต่างๆ จะถูกปิดกั้นด้วย 2% BSA เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ส่วนต่างๆ ได้รับการบำบัดข้ามคืนที่ 4 °C ด้วย CD45 (Bio-RAD, MCA 1258GT, การเจือจาง 1:100) หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกบำบัดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยสารต่อต้านกระต่าย IgG-HRP (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ดัลลาส, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา, SC-2357, เจือจาง 1:100) และย้อมเป็นเวลา 1 นาทีด้วย 3 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์, เบอร์ลินเกม, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) สไลด์ถูกย้อมเป็นเวลา 30 วินาทีด้วยฮีมาทอกซิลินและล้างด้วยน้ำประปา จากนั้นนำชิ้นส่วนมาปิดฝาและติดตั้งด้วย Permount™ Mounting Medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ตรวจสอบสไลด์ทั้งหมดและถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Olympus, CX43, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) ซอฟต์แวร์ ImageJ (เวอร์ชัน 1.53, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)⁴⁸ ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลเชิงปริมาณ

การเพาะเลี้ยงเซลล์ ARPE-19

เซลล์ ARPE-19 ของเยื่อบุผิวจอประสาทตามนุษย์ (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA) ได้รับการเพาะเลี้ยงในสื่อ DMEM / F-12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) เสริมด้วย 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT , สหรัฐอเมริกา) และ 1% เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (HyClone Laboratories) เซลล์ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 2 × 10⁵ ต่อหลุมในจาน 6 หลุมและเพาะเลี้ยงเพื่อกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบและเอนโดพลาสซึม

ความมีชีวิตของเซลล์

ผลกระทบของ ต. ลูเทีย ความมีชีวิตของเซลล์ได้รับการประเมินโดยการทดสอบ MTT ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้⁴⁹ แต่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ถูกชุบในเพลตเพาะเลี้ยง 96 หลุมที่ความหนาแน่น 1.5 × 10⁴ เซลล์/หลุม และบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์จะถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ ต. ลูเทีย และบ่มต่ออีก 24 ชม. ส่วนลอยเหนือตะกอนของแต่ละหลุมถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดซึ่งประกอบด้วย MTT 0.5 มก./มล. และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกำจัดออกและตะกอนฟอร์มาซานที่สร้างขึ้นถูกละลายในไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ 200 ไมโครลิตร วัดการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตร ความมีชีวิตของเซลล์ถูกคำนวณค่อนข้างเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ

การวิเคราะห์แบบตะวันตก

Western blotting ดำเนินการเพื่อกำหนดเส้นทางการส่งสัญญาณของเซลล์ที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบของ ต. ลูเทีย ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้การศึกษา⁴⁹แต่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ ARPE-19 ที่ไหลมารวมกันถูกอดอาหารใน DMEM:F12 ซึ่งมียาปฏิชีวนะ 1% FBS และ 1% เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นนำเซลล์มาบำบัดด้วย ต. ลูเทีย (50 และ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและจากนั้นกระตุ้นด้วย TNF-α 20 นาโนกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 15 นาที เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย DPBS เย็นน้ำแข็งแล้ว lysed ในบัฟเฟอร์การสกัดโปรตีน (เทคโนโลยีชีวภาพ iNtRON, Gyeonggi-do, เกาหลี) เสริมด้วยค็อกเทลของโปรตีเอสและสารยับยั้งฟอสฟาเตส ส่วนลอยเหนือตะกอนของไลซีนได้มาจากการปั่นเหวี่ยง (14,000×ก, 30 นาที, 4 °C) และประเมินความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน DCTM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) โปรตีนเซลล์ในปริมาณเท่ากัน (15–25 ไมโครกรัม) ถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้ม PVDF เมมเบรนถูกบ่มด้วยอัลบูมินในซีรัมวัวหรือนมพร่องมันเนย 5% จากนั้นบ่มด้วยการเจือจาง 1:2000 ของแอนติบอดีปฐมภูมิ (แอนติ-ฟอสโฟ-ERK, แอนติ-ERK, แอนติ-ฟอสโฟ-JNK, แอนติ-JNK, แอนติ-ฟอสโฟ-p38 , แอนติ-p38, แอนติ-ฟอสโฟ-AKT, แอนติ-AKT, แอนติ-ฟอสโฟ-IκB-α, แอนติ-IκB-α, แอนติ-ฟอสโฟ-p65, แอนติ-p65, แอนติ-α-tubulin และแอนติ-β-ออกฤทธิ์ ) ที่ 4 °C และ 12 ชม. จากนั้นเมมเบรนถูกล้างด้วย TBS-T และบำบัด 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบกับ HRP ต้านกระต่ายที่การเจือจาง 1:10,000 ตรวจพบแถบโปรตีนโดยใช้พื้นผิวความไวสูงสุด SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific) และแสดงภาพในระบบเอกสารเจล iBright CL1000 (Thermo Fisher Scientific) ความหนาแน่นของโปรตีนบล็อตแต่ละอันถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image J (เวอร์ชัน 1.53, NIH)⁴⁸.

การสกัด PUFA ทั้งหมดจาก ต. ลูเทีย

PUFA ทั้งหมดถูกดึงมาจาก ต. ลูเทีย โดยใช้เทคนิคโฟลช์⁵⁰. โดยสรุป ตัวอย่าง 100 มก. ถูกใส่ลงในขวดที่ประกอบด้วย CH 5 มล₃สารละลาย Cl:MeOH (2:1, ปริมาตร/ปริมาตร) และอัลตราโซนิกเป็นเวลา 15 นาที ระบบกันสะเทือนถูกทำให้ชัดเจนโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที นา₂ดังนั้น₄ ถูกเติมลงในส่วนลอยเหนือตะกอนซึ่งจากนั้นถูกกรองเพื่อกำจัดน้ำที่เหลืออยู่ ขั้นตอนนี้ถูกทำซ้ำอีกสองครั้ง จากนั้นสารละลายจะถูกทำให้เข้มข้นภายใต้ก๊าซไนโตรเจนเพื่อให้ได้ไขมันสาหร่ายบริสุทธิ์

เมทิลเลชั่นของกรดไขมัน

เมทิเลชันของกรดไขมันถูกดำเนินการเพื่อเตรียมตัวอย่างไขมันสำหรับการวิเคราะห์แก๊สโครมาโทกราฟี (GC) วัสดุที่สกัดถูกเติมลงในขวดขนาด 10 มล. ตามด้วยของผสม 0.5 นอร์มัล NaOH:MeOH 1 มล. สารละลายนี้ประกอบด้วยเกลียวภายใน (กรดวาเลริก) 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ของผสมถูกเขย่าเป็นเวลา 30 วินาที และจากนั้นบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่ 80 °C จากนั้น ของผสมถูกทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที, และจากนั้น 2 มิลลิลิตรของโบรอน ไตรฟลูออไรด์:MeOH ถูกเติมลงไป และจากนั้นกวนเป็นเวลา 30 วินาที ของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่ 80 °C ตามด้วยการทำให้เย็นลงเป็นเวลา 10 นาที NaCl อิ่มตัวยวดยิ่งปริมาตร 2 มิลลิลิตรถูกเติมเพื่อกระตุ้นการแยกเฟสและการสะสมกรดไขมัน ต่อไป 1.5 มล n-เฮกเซนถูกเติมลงไปและของผสมถูกหมุนวนเป็นเวลา 30 วินาที ก่อนที่จะทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที ชั้นถูกแยกออกและส่วนลอยเหนือของเหลวถูกเอาออกจากของผสมและน้ำถูกกำจัดออกทั้งหมดโดยใช้ Na ที่อิ่มตัว₂ดังนั้น₄ กรอง.

การจำแนกกรดไขมัน

ตรวจสอบกรดไขมันเมทิลเอสเทอร์ (FAMEs) โดยใช้ GC ที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับไอออไนเซชันเปลวไฟ (FID; Agilent 7890A, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) ตัวอย่าง (1 µL) ถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์ HP-88 ของ GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) (100 ม. × 250 μm ID, ฟิล์ม 0.2 μm) การวิเคราะห์ GC ดำเนินการดังต่อไปนี้: ตัวอย่างถูกเก็บไว้ในตอนแรกที่ 140 °C เป็นเวลา 5 นาที และจากนั้นอุณหภูมิเพิ่มขึ้นที่ 4 °C/นาทีเป็น 240 °C เป็นเวลา 15 นาที อัตราการไหลของคอลัมน์ถูกคงที่ที่ 1 มิลลิลิตร/นาที ก๊าซไนโตรเจนถูกใช้เป็นก๊าซพาหะสำหรับการวิเคราะห์ FID ถูกตั้งไว้ที่ 280 °C และอัตราส่วนการแยกคือ 30:1 ชื่อเสียงได้รับการระบุโดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานที่ทราบ แต่ละตัวอย่างถูกวัดโดยการวิเคราะห์ GC เป็นสามเท่า

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวกับการวิเคราะห์หลังการวิเคราะห์ของ Tukey โดย SPSS เวอร์ชัน 18.0 (IBM Co., Armonk, NY, USA) มีการจำลองแบบอิสระอย่างน้อยสามครั้งสำหรับการทดลองแต่ละครั้ง