NF-κB阻害によるドライアイ症候群に対するTisochrysis luteaの保護効果

ドライアイ症候群（DES）の有病率は世界中で増加しており、全成人の約 50% が影響を受けています1。 DES は、涙液層の不安定性と高浸透圧、眼表面の炎症と損傷、神経感覚異常を特徴とする多因子性の眼表面疾患です。

2024 年 1 月 15 日

材料

インビボ/インビトロ材料

T.ルテア は、Microalgae ask us Corp. (江陵、韓国) から入手しました。スコポラミン、フルオレセイン、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) は、動物実験用に Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入しました。ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM):F12、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、ウシ胎児血清 (FBS)、および 0.25% トリプシン - EDTA 溶液は、Life Technologies (米国カリフォルニア州カールズバッド) から入手しました。 10,000 U/mL ペニシリンおよび 10,000 μg/mL ストレプトマイシンを含む抗生物質溶液は、Hyclone Laboratories Inc. (米国ユタ州サウスローガン) から購入しました。組換えヒト TNF-α は R&D system (米国ミネソタ州ミネアポリス) から入手しました。抗細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK)、抗 c-jun N 末端キナーゼ (JNK)、抗 p38、抗 α-チューブリン、および抗 β-アクチンを含む一次抗体は、Santa Cruz Biotechnology (米国カリフォルニア州サンタクルーズ）。他の一次抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体は、Cell Signaling Technology, Inc (米国マサチューセッツ州ビバリー) から入手しました。臭化 3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム (MTT) を含む化学物質は、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入しました。

化学分析材料

PUFA は、Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入した 37 種類の PUFA 標準物質を含む溶液を使用して同定されました。吉草酸は、内部標準として使用するために Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から入手しました。三フッ化ホウ素メタノール溶液を含む溶媒、 n-ヘキサン、Na₂それで₄、CH₃PUFA を抽出するために使用される Cl、MeOH、および NaCl T.ルテア これらは、Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。

倫理的声明

この研究は、韓国科学技術研究院（KIST）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）：KIST No. 2020-002、江陵研究所によって承認され、視覚と眼科学研究協会の声明に従った。眼科および視覚研究における動物の使用。さらに、当社は「Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)」の推奨事項に従います。すべての手順は、適用される規制およびガイドラインに従って実施されました。

動物実験とDESモデルの誘導

マウスは空調された動物室に飼育され、22 °C ± 2 °C、湿度 50% ± 10%、および 12 時間明/12 時間暗の概日サイクルに維持されました。食物および水は自由に与えた。マウスを 1 週間順応させた後、生後 6 週間の雄 BALB/c マウス 7 匹からなる 5 つのグループにランダムに分けました (Orientbio、京畿道、韓国)。 DES は、リン酸緩衝食塩水 (PBS; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で希釈した 200 μL (2.5 mg/mL) のスコポラミンの腹腔内注射により、マウスに 1 日 2 回実験的に誘導されました。 T.ルテア ２００μＬの蒸留水中の０（ビヒクル対照）、１００、１５０、または３００ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスの群に毎日経口投与した。対照群にはスコポラミンを含まない PBS を投与しました。いつ T.ルテア 経口投与した場合、対照群およびDES群には200μLの蒸留水を使用した。２週間後、１分間目を閉じる前に、側頭まぶたの下３分の１に配置された標準的なシルマー試験ストリップを使用して、涙の産生を定量化した。次いで、ストリップを取り外し、湿潤点の長さをミリメートル単位で測定して、シルマー試験値を決定した。角膜表面の染色を使用して、角膜表面の変化の程度を決定した。３１ＴＰ３Ｔフルオレセインを下側結膜に１滴注射した後、角膜表面を観察し、スコアを付けた。角膜染色を盲検的に評価した。マウスは頚椎脱臼により安楽死させた。マウスのまぶたをはじき、鉗子を使用して眼球から視神経を切り出し、角膜を除去することにより、角膜を除去した。水晶体を角膜内から取り出し、-80 °C で保存しました。鉗子を使用してマウスの下顎から涙腺を除去し、引っ張られた領域の表皮を切り取って顔の下半分を露出させた。下顎近くの涙腺を固定して除去し、光から保護して -80 °C で保管しました。

組織学

角膜表皮および涙腺組織を収集し、10% ホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋および切片化の処理を行いました。切片を H&E で染色し、顕微鏡 (TE-2000U、ニコン、東京、日本) を使用して 40 倍の倍率で検査しました。角膜中央上皮の厚さは、各角膜を 5 つのセクションに分割することによって決定されました。

免疫組織化学 (IHC) 分析のための DAB 染色

BALB/c マウスの涙腺から組織を採取し、10% ホルムアルデヒドで固定しました。固定した涙腺組織をパラフィン包埋し、切片（5μm）にし、キシレン（Junsei、東京、日本）を使用してパラフィンを3分間3回除去しました。切片を 100、95、70、および 50% エタノール中で 1 分間水和させました。涙腺抗原は、TRIS-EDTA 緩衝液 (pH 9.0) を使用してマイクロ波によって抽出されました。 3% 過酸化水素を組織スライドに 15 分間適用した後、切片を 2% BSA で室温で 1 時間ブロックしました。切片を、CD45 (Bio-RAD、MCA 1258GT、1:100 希釈) を用いて 4 °C で一晩処理しました。 PBS で洗浄した後、細胞を抗ウサギ IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国、SC-2357、1:100 希釈) で室温で 2 時間処理し、3 で 1 分間染色しました。 3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩（Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）。スライドをヘマトキシリンで 30 秒間染色し、水道水ですすいだ。次いで、スライスにカバースリップをかけ、Permount™ mounting Medium (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) でマウントしました。すべてのスライドを光学顕微鏡 (Olympus、CX43、Olympus Optical Co.、東京、日本) を使用して検査し、写真撮影しました。 ImageJ ソフトウェア (バージョン 1.53、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国)⁴⁸ 定量的なデータ分析を実行するために使用されました。

ARPE-19 細胞培養

ヒト網膜上皮 ARPE-19 細胞 (American Type Culture Collection、ATCC、米国バージニア州マナサス) を、10% FBS (HyClone Laboratories、ユタ州ローガン) を添加した DMEM/F-12 培地 (Gibco、米国カリフォルニア州カールズバッド) で培養しました。、米国）および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン（HyClone Laboratories）。細胞は 2 × 10 個の密度で播種されました。⁵ 6ウェルプレートのウェルごとに培養し、炎症反応および小胞体反応を誘導します。

細胞生存率

の効果 T.ルテア 細胞生存率は、以前の研究に記載されているように、MTT アッセイによって評価されました。⁴⁹ ただし、わずかな変更が加えられています。細胞を 1.5 × 10 の密度で 96 ウェル培養プレートに播種しました。⁴ 細胞/ウェルで24時間インキュベートしました。次に、細胞をさまざまな濃度の T.ルテア さらに24時間インキュベートしました。各ウェルの上清を、0.5 mg/mL の MTT を含む新鮮な増殖培地と交換し、1 時間インキュベートしました。上清を除去し、生成したホルマザン沈殿物を２００μＬのジメチルスルホキシドに溶解した。吸光度は570nmで測定した。細胞生存率は、陰性対照群と比較したパーセンテージとして相対的に計算されました。

ウェスタンブロット分析

ウェスタンブロッティングは、抗炎症作用の根底にある細胞シグナル伝達経路を決定するために実施されました。 T.ルテア 前述したように研究⁴⁹、ただし小さな変更が加えられています。コンフルエントな ARPE-19 細胞を、1% FBS および 1% 抗生物質を含む DMEM:F12 中で 24 時間飢餓状態にしました。次いで、細胞を次のもので処理した。 T.ルテア (50 および 100 μg/mL) で 2 時間刺激し、その後 20 ng/mL の TNF-α で 15 分間刺激しました。細胞を氷冷したDPBSで3回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを添加したタンパク質抽出緩衝液(iNtRON Biotechnology、京畿道、韓国)中で溶解した。ライセートの上清を遠心分離 (14,000×) によって取得しました。g、30分、4℃）、それらのタンパク質濃度はDCTMタンパク質アッセイキット（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して推定されました。等量 (15 ～ 25 μg) の細胞タンパク質を SDS-PAGE で分離し、PVDF 膜に転写しました。メンブレンを 5% ウシ血清アルブミンまたはスキムミルクとインキュベートし、次に 1:2000 希釈の一次抗体 (抗ホスホ ERK、抗 ERK、抗ホスホ JNK、抗 JNK、抗ホスホ p38) とインキュベートしました。、抗 p38、抗ホスホ AKT、抗 AKT、抗ホスホ IκB-α、抗 IκB-α、抗ホスホ p65、抗 p65、抗 α-チューブリンおよび抗 β-アクション) 4 °C で 12 時間。次いで、膜をTBS-Tでリンスし、1:10,000の希釈の抗ウサギHRP結合二次抗体で室温で1時間処理した。 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) を使用してタンパク質バンドを検出し、iBright CL1000 ゲルドキュメンテーションシステム (Thermo Fisher Scientific) で視覚化しました。各タンパク質ブロットの密度は、Image J ソフトウェア (バージョン 1.53、NIH) を使用して測定しました。⁴⁸.

総PUFA抽出量 T.ルテア

総PUFAは以下から抽出されました T.ルテア フォルチテクニックを使って⁵⁰。簡単に説明すると、100 mg のサンプルを 5 mL の CH が入ったバイアルに入れました。₃Cl:MeOH (2:1、v/v) 溶液を加え、15 分間超音波処理しました。懸濁液を10,000 rpmで5分間遠心分離して清澄化した。ナ₂それで₄ を上清に加え、次いで濾過して残留水を除去した。このステップをさらに 2 回繰り返しました。次いで、溶液を窒素ガス下で濃縮して、純粋な藻類脂質を得た。

脂肪酸メチル化

脂肪酸メチル化を実行して、ガスクロマトグラフィー (GC) 分析用の脂質サンプルを調製しました。抽出した物質を10 mLバイアルに加え、続いて1 mLの0.5 N NaOH:MeOH混合物を加えた。この溶液には 400 μg/mL の内部ストランド (吉草酸) が含まれています。混合物を 30 秒間振盪し、その後 80 °C で 20 分間インキュベートしました。次いで、混合物を室温で５分間冷却し、次いで２ｍＬの三フッ化ホウ素：ＭｅＯＨを添加し、次いで３０秒間撹拌した。混合物を80℃で20分間インキュベートし、その後10分間冷却した。 2 mL の過飽和 NaCl を添加して、相分離と脂肪酸の収集を誘導しました。次に、1.5mL n−ヘキサンを加え、混合物を３０秒間ボルテックスした後、室温で２０分間冷却した。層を分離し、液体上澄みを混合物から除去し、飽和NaHCO を使用して水を完全に除去した。₂それで₄ フィルター。

脂肪酸の同定

脂肪酸メチルエステル (FAME) は、炎イオン化検出器 (FID; Agilent 7890A、Agilent Technologies、米国デラウェア州ウィルミントン) を備えた GC を使用して検査しました。サンプル (1 μL) を GC の HP-88 カラム (J&W 112-88A7、Agilent Technologies、ウィルミントン、デラウェア州、米国) (100 m × 250 μm ID、0.2 μm フィルム) に注入しました。 GC 分析は次のように実行されました。サンプルは最初に 140 °C で 5 分間保持され、次に温度を 4 °C/min で 15 分間かけて 240 °C まで上昇させました。カラムの流速は 1 mL/min に固定しました。分析用のキャリアガスとして窒素ガスを使用し、FID を 280 °C に設定し、スプリット比を 30:1 に設定しました。 FAME は、既知の標準と比較することによって特定されました。各サンプルを GC 分析により 3 回測定しました。