ブレビスカピンは、セロトニンを調節することで心筋のグルコースと脂質の代謝を改造し、ドキソルビシン誘発性心毒性を軽減します。

試薬

以下の試薬を使用しました: DMEM、FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン (Meilunbio、中国、大連)、cTnI Elisa キット (Sangon Biotech、中国、上海)、TNF-α、IL-1β、および IL-6 Elisa キット (MyBioSource、サンディエゴ、米国）、MDA キット、SOD キット、および NADH キット（Solarbio、北京、中国）、CCK-8 キット（Beyotime Biotechnology、上海、中国）、ROS 蛍光定量キット、JC-1 蛍光色素、タンパク質抽出キット、およびBCAキット（Meilunbio、大連、中国）。 IL-1 (1:100)、PINK1(1:1,000)、パーキン (1:1,000)、AMPK(1:1,000)、Akt (1:1,000)、P13K(1:1,000)、Tom20 (1:1,000) 、β-チューブリン (1:1,000)、mTOR (1:1,000)、および HRP 結合 GAPDH (1:1,000) 抗体は、Abclonal Biotechnology (武漢、中国) から入手しました。 RIPA 溶解バッファーとローディング バッファーは Meilunbio (大連、中国) から購入しました。 PVDF 膜は Merck (米国ニュージャージー州) から入手しました。 DMSO は Macklin (中国、上海) から購入し、ドキソルビシン、ブレビスカピン、およびデクスラゾキサンは Widely (中国、武漢) から購入しました。 Mdivi-1 阻害剤は、Selleck Chemicals (ヒューストン、米国) から購入しました。

細胞培養条件と細胞株

細胞培養用の培地およびサプリメントは Gibco-Invitrogen (米国カリフォルニア州カールズバッド) から購入し、プラスチック製品は Corning (米国ニューヨーク州コーニング) から購入しました。 H9c2 胎児ラット心臓由来心筋芽細胞 (ATCC、CRL-1446) を、10% ウシ胎児血清、100 単位/ml ペニシリン G ナトリウム、および 100 μg/ml 硫酸ストレプトマイシンを含む DMEM 中で培養しました (37°C、5% CO₂）。 MCF-7 ヒト転移性乳がん細胞 (iCell、iCell-h129) を、10% ウシ胎児血清、100 単位/ml ペニシリン G ナトリウム、および 100 μg/ml 硫酸ストレプトマイシンを添加した 1,640 培地で培養しました。 4T1 マウス乳がん細胞 (ATCC、FS-0158) を、10% ウシ胎児血清、100 単位/ml ペニシリン G ナトリウム、および 100 μg/ml 硫酸ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地で培養しました。

細胞が 80 ～ 90% コンフルエンスに達したときに定期的に継代し、96 ウェル プレート (1 × 100) に播種しました。⁴ 細胞/ウェル)。 H9c2 細胞をコントロールの 5 μM Dox (郭ら、2013)、5μM Dox+20μM Dexra (サングウェニほか、2020)、または 5 μM Dox + 200 μM ブレビスカピン (リーら、2022) それぞれ 24 時間。 DMEMのみで処理した細胞をブランクコントロールとして使用し、Dexraをポジティブコントロールとして使用しました。最後に、ミトコンドリア分裂の阻害剤である Mdivi-1 (5μM、DMSO 溶液) も注射しました (ニュー他、2021).

酸化ストレスの評価

細胞内 ROS レベルは、製造業者の指示に従って蛍光色素 DCFH-DA を使用して測定しました。簡単に説明すると、DCFH-DA 溶液 (1 μM) を PBS で調製し、6 ウェル プレートで培養した H9c2 細胞に添加した後、37℃で 30 分間インキュベートしました。インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄した。 Leica Microsystems, Ltd.の蛍光顕微鏡を使用して、蛍光顕微鏡写真を倍率20倍で撮影した。ROSレベルは、Beckmanフローサイトメーター(Beckman、カリフォルニア、米国)を用いて定量した。

酵素指数の決定

ＳＯＤおよびＮＡＤＨの活性は、製造業者の指示に従って活性アッセイキットを使用して測定した。吸光度および発光は、マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer、米国マサチューセッツ州）を使用して測定した。

電子顕微鏡法

細胞を 0.5% グルタルアルデヒド固定液で 4 °C で 15 ～ 30 分間固定し、10,000 ～ 13,000 rpm で 5 分間遠心分離して回収しました。細胞をさらに 3% グルタルアルデヒドで 4℃で一晩固定し、次に 1% 四酸化オスミウムで室温で 2 時間処理しました。その後、サンプルをアセトン勾配で脱水し、Epon 812 に包埋し、光学位置決めを行って超薄切片に切断しました。切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色した。ミトコンドリアの超微細構造は、H-7650 透過型電子顕微鏡 (日立、東京、日本) を使用して検査されました。

ミトコンドリア呼吸の測定

約10⁶ 細胞を使用して、O2K呼吸計（Oroboros Instruments、オーストリア）でミトコンドリア呼吸を測定しました。酸素濃度は、Oroboros DatLab 7.4 ソフトウェアを使用して測定および分析されました。簡単に言うと、細胞のみでリーク呼吸状態が記録され、5 mM ADP の添加により電子伝達がリン酸化と共役し、複合体 I によってサポートされる状態 3 の呼吸が記録されました。複合体 I と複合体 II からの平行電子入力による最大状態 3 呼吸は、10 mM コハク酸塩の添加によって記録され、複合体 II に支えられた呼吸は 6.25 μM ロテノンの存在下で測定されました。最大の電子移動容量は、5 μM シアン化カルボニル p-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP) の存在下で記録されました。最後に、複合体Ⅲを完成させ、すべての電子伝達を遮断するアンチマイシン（Ama）を投与し、酸素消費率を非ミトコンドリア酸素消費量として測定した。

ミトコンドリア膜電位の変化 (ΔΨm) の測定

5.5',6.6'-テトラクロロ-1.1',3.3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド (JC-1) 染色を使用して、H9c2 細胞のミトコンドリア膜電位を評価しました。簡単に説明すると、所定の実験条件に従って、H9c2 細胞を温かいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で洗浄した後、100 μL の 2 μM JC-1 溶液 (フェノールレッドを含まない DMEM に混合) で染色し、標準的な細胞培養下でインキュベートしました。暗所で30分間の条件。インキュベーション後、細胞を温DPBSで洗浄し、Leica Microsystems CMS GmbH倒立蛍光顕微鏡(Leica Camera AG、バルナック、ドイツ)を使用して20倍の倍率で蛍光顕微鏡写真を撮影した。

免疫蛍光

ミトコンドリアの局在を評価するために、カバースリップ上で増殖させた細胞を冷PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定しました。次に、細胞を0.5% Triton X-100で20分間透過処理し、5%ヤギ血清で30分間ブロックした。細胞を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、二次抗体とともに1時間インキュベートしました。 3 回洗浄した後、細胞を 4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化しました。

ATP測定

さらに、細胞内 ATP 濃度は、製造元のプロトコールに従って ATP アッセイ キットを使用して測定しました。ピペッティングを繰り返して細胞を溶解バッファーに溶解し、4℃、13,000gで10分間遠心分離しました。上清はATPレベルの分析に使用され、タンパク質濃度はBCAアッセイによって測定されました。 ５０μｌの上清を１００μｌのＡＴＰ検出溶液に添加し、室温で５分間インキュベートし、直ちに混合し、ルミノメーター（Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ３）を使用して発光を測定した。 ATPの濃度を標準曲線に従って計算し、nmol/μgタンパク質に変換した。

ウェスタンブロッティング

タンパク質発現はウェスタンブロッティングによって評価され、デンシトメトリーによって定量されました。 10 cm 細胞培養皿内の Dox および Dox + Brev 処理 H9c2 細胞を RIPA 溶解バッファーで溶解しました。 5 mg の組織を採取し、10 ml の溶解バッファーを加えます。ブラッドフォード法を使用して、BSAを標準として利用してタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をローディングバッファー（5X）と混合し、95℃で5分間煮沸しました。次に、タンパク質を 10%-12% SDS-ポリアクリルアミドゲル (SDS-PAGE) での電気泳動によって分離し、PVDF メンブレンに転写しました。 TBST中の5%ミルクで室温で2時間ブロッキングした後、膜をウサギポリクローナルGAPDHなどの特異的抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。タンパク質発現およびリン酸化の WB 分析は、AMPK、Parkin、PINK1、Akt、PI3K、Tom20 に対する抗体を使用して実行され、GAPDH が内部対照として使用されました。特定のシグナルは、Bio-Rad gel doc システム (Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア、米国) を使用して視覚化されました。データは平均値 ± SD (n = 3)、ImageJ 分析によって定量化されます。

畜産

実験には生後 8 週齢の雌 C57BL/6 マウス (SiPeiFu、北京、中国) を使用しました。動物はケージに入れ、湿度 50±TP3T、25℃±2℃で 12 時間明/12 時間暗サイクルで飼育しました。動物には標準的なペレット食と水を自由に摂取させた。 4℃、200 gで10分間の遠心分離によって血漿を得、抽出前に-80℃に保った。

調査は以下に準拠しています。 実験動物の管理と使用に関するガイド 米国国立衛生研究所によって発行されました (NIH Publication No. 85–23、1985 年改訂)。

動物実験プロトコル

マウスは、対照群、モデル群（Dox 群）、3 用量の Dox + Brev 群、および Dox + Dexra 群を含む 6 つの治療群にランダムに割り当てられました。

人間の治療計画を模倣するために、累積用量 12 mg/kg の Dox が投与されました。 経由 対照群を除いて、毎週３回の腹腔内注射（０日目、７日目、および１４日目に４ｍｇ／ｋｇ）。

Brev の効果を調査するには 生体内では、 マウスをBrevで治療し、続いて毎日4.8mg/kgおよび16mg/kgのBrevを3週間腹腔内注射し、Dox+Dexra治療群のマウスにはDoxに加えて12mg/kgのDexraを3週間腹腔内注射した。処理。 (アレクサンドル他、2020）。ブレブとデクスラはDox注射後に治療を受けた。 Dox の最初の注射から 3 週間後に、生存率を毎日モニタリングし、心エコー検査によって心臓機能を評価しました (リーら、2018).

対照群には同量の生理食塩水を注射した。 Dox投与の1週間後にマウスを屠殺した。

腫瘍研究

マウスに1×10 を皮下注射した。⁵ 4T1 乳房腫瘍細胞。細胞注射の 1 週間後、腫瘍の平均直径が 2 mm を超えたとき、マウスを前述のように Dox またはブレビスカピンで治療しました。腫瘍サイズは週に 2 回、最大 4 週間測定され、腫瘍体積は次の式で計算されました: V = 4π/3×(L/2)2×(W/2)、ここで、V、L、および W は次の式を表します。それぞれ腫瘍の体積、長さ、幅。

¹⁸F-フルオロデオキシグルコース PET/CT イメージング

Dox およびブレビスカピン群のマウス (一晩絶食) を 2% イソフルランで麻酔し、約 11MBq/0.2 ml のフルオロデオキシグルコース (FDG) PET を注射しました。 経由 尾静脈を採取し、ケージに戻しました。 40分後、マウスを2%イソフルランで再度麻酔し、microPET Focus 220（Siemens Company、ベルリン、ドイツ）の定位ベッド上に置いた。次に、20 分間の静的 PET スキャンが開始されました。その後、マウスは、PET 画像との解剖学的位置合わせのために、microCAT II (Siemens Company、ベルリン、ドイツ) で X 線ビーム強度 180 mAs、X 線管電圧 80 kVp で画像化されました。

患者

4 時間以上絶食し、血糖値が 120 mg/dl 未満であることを確認した後、すべての患者に次の薬物の静脈内投与が行われました。 ¹⁸F-FDG (5.5 MBq/kg)。 PET/CT スキャンは、結合 PET/CT バイオグラフ (Siemens Company、ベルリン、ドイツ) を使用して、注射の 60 分後に開始されました。すべてのスキャンは 3 次元モデルで実行されました。減衰補正と解剖学的相関関係を調べるために、まず低線量 CT スキャンが行われました。倫理的クリアランスは、青島大学附属病院発行の倫理委員会承認文書ガイド（QDU-HEC-2022057）に準拠しています。

心機能および病理組織学の分析

各グループのマウス心臓組織を 4% パラホルムアルデヒド中に保存し、パラフィンワックスに包埋し、4 mm 切片に連続的に切断しました。組織切片を脱パラフィンした 経由 キシレンに浸漬し（3 回、各 5 分間）、降順の一連のアルコールを使用して再水和しました（100%、90%、85%、および 75% アルコール、各 5 分間）。組織学的分析のために、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。生検サンプルは、心臓の形態学的変化および線維性変化を調査するために、マッソントリクローム染色を使用して染色されました。青色の染色はコラーゲンの蓄積を表しました。免疫組織化学は、ヒストン単純染色キット (ニチレイ、東京、日本) を製造者の指示に従って使用して実施しました。切片をメタノール中の 3% H2O2 で 15 分間処理して内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、次に一次抗体 IL-1 (1:100) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。次いで、Ｌｅｉｃａ ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓのＣＭＳ ＧｍｂＨ倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｃａｍｅｒａ ＡＧ、Ｂａｒｎａｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して超微細構造を２０倍の倍率で観察した。

血糖値の測定

マウスには通常の固形飼料を与えて飼育した。実験当日、マウスを6時間(午前8時から)絶食させ、血液を採取した。 経由 血糖値の測定には尾静脈を使用します。

H9c2 ラット心筋芽細胞をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、遠心分離して超音波破砕し、標準的な細胞培養条件下で 10 分間インキュベートしました。インキュベーション後、マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer、米国マサチューセッツ州）を使用して吸光度を測定しました。

酵素免疫測定法

マウス組織を溶解バッファーで溶解しました。サンプルを Qsonica ホモジナイザーで 30 Hz パルスを使用して 20 秒間超音波処理し、その後 12,000 g で 10 分間遠心分離しました。上清を収集し、200 μl バイアルに等分し、-80°C で保存しました。サンプルのタンパク質濃度はBCAアッセイによって定量されました。メーカーのプロトコールに従って、TNF-α、IL-1β、およびIL-6の酵素結合免疫吸着アッセイキットを使用してサンプルを分析しました。光学密度は、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ（商標）マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州、米国）を使用して４５０ｎｍで測定した。

マウスのメタボローム変化の測定

血液サンプルを再懸濁し、氷上でインキュベートし、遠心分離し、最終濃度まで希釈し、遠心分離しました。最後に、上清を分析のために LC-MS/MS システムに注入しました。 UHPLC-MS/MS 分析は、Orbitrap Q Exactive と組み合わせた Vanquish UHPLC システム (Thermo Fisher、マサチューセッツ州、米国) を使用して実行されました。^TM HF 質量分析計 (Thermo Fisher、マサチューセッツ州、米国)。同定された代謝物には、KEGG データベース、HMDB データベース、および LIPID Maps データベースを使用して注釈が付けられました。主成分分析 (PCA) と部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) は、metaX を使用して実行されました。単変量解析を適用しました (t-test) 統計的有意性 (p-価値）。 VIP>1 の代謝物、 p 値 < 0.05、および倍率変化 ≥2 または ≤0.5 は、差次的に豊富な代謝産物であると考えられました。

アントラサイクリン系薬剤は心筋酸素消費量を増加させ、ATP 生成速度を低下させます。

興味深いことに、この代謝補償により心筋の ROS レベルが増加し、酸化ストレスの増加につながりました (図2A）。 O2K エネルギー代謝分析により、Dox が心筋酸素消費量を増加させることが示されました (図2B) そしてミトコンドリア膜の過分極を引き起こしました(図2C) (これはミトコンドリアの酸化ストレスレベルの上昇の兆候でもあり、心虚血再灌流のモデルでよく見られます)。 JC-1 染色では、Dox 曝露により、少数の生存細胞の膜電位の増加 (赤色蛍光強度の増強) が引き起こされたことも示されました (図2D）。酸素消費量の増加や脂質の酸化などの代償プロセスが心臓で発生しましたが、残念なことに、心筋での ATP 生成速度は、グルコース代謝の低下に応じて大幅に低下しました。図2E）。酸素消費速度と ATP 生成速度を比較すると、Dox 曝露により心筋は大量の酸素を消費するが、ATP は少量しか生成されないことがわかりました (図2F）、心臓への負担が大幅に増加します。このエネルギー出力の不足により、Dox グループのエネルギー受容体 AMPK のレベルが大幅に増加しました (図2G）。したがって、アントラサイクリンによるグルコース代謝障害に応じて、心臓は高い酸素消費率と低いATP産生率を示し、この現象は心筋のエネルギー要求を完全には満たさず、過剰な酸化ストレスを引き起こすのではないかと仮説を立てています。したがって、エネルギーギャップに応答して、心臓内の脂質酸化が増加し、より多くのROSが蓄積し、この貧弱なフィードバック経路がDICの重要な要因である可能性があると推測されています。

新しい心臓保護剤ブレビスカピンは心臓のグルコース代謝を促進し、Dox 誘発性心筋症を抑制します

前述の結果に触発されて、我々は心血管疾患の治療に使用されるフラボノイド ブレビスカピンの DIC の進行に対する保護効果を代謝の観点から調査しました。実験プロトコルを以下に示します。 図3A、 そして ¹⁸最初のドキソルビシン注射から 1 週間後のマウスを使用して、F-FDG PET/CT イメージングを実行しました。に示すように 図3B、心臓取り込みは、Dox 治療単独群よりもブレビスカピン治療群の方が有意に高く、ブレビスカピンの介入が Dox による心臓のグルコース代謝の減少を逆転させ、心臓のエネルギー代謝をリモデリングできる可能性があることを示唆しています。次に、ブレビスカピンによる治療後の心臓機能と病理学的変化が検査され、臨床薬デクスラゾキサン (Dexra) が陽性対照として使用されました。心エコー検査では、 図3C Dox グループの LVEF と LVFS は対照グループよりも有意に低く、LVESV と LVD は対照グループより有意に高いことが示されました。これらの結果は、Dox 治療後にマウスの左心室収縮機能が低下し、この研究における Dox 誘発心筋損傷は拡張型心筋症に類似していたことを示唆しています。 Dox は収縮機能を低下させます。これは以前に報告されたものと同様です (ベンチュリーニら、1996; サン他、2022）。ドキソルビシンのみで治療した動物の心臓と比較して、Brev と Dox で治療した動物の心臓ではすべての機能が回復しました。 cTnI は心筋損傷のバイオマーカーです (ソラーロとソラーロ、2020）。 cTnIの濃度は、対照群と比較してドキソルビシン単独で治療したマウスで有意に増加し、異なる濃度のBrevはより良い効果を示した(図3D）。さらに、さまざまな治療後の病理学的心臓組織の染色により、対照群のマウスの心臓組織構造が正常であることが示されました。対照群のマウスとは異なり、Dox 群のマウスは、壊死、細胞内浮腫、筋原線維障害および破裂、心臓線維の波状変性などの多数の心臓病変を示しました。興味深いことに、ブレビスカピンによるプレコンディショニングはこの種の傷害を予防し、心臓脂質の過剰な蓄積を軽減し、心筋の恒常性を回復しました（図3F）。心筋のマッソン染色では、Dox 治療後に間質性線維症が有意に増加し、Brev 介入により心線維症の程度が減少したことが示されました (図3E）。心臓超音波データは、LVESV と LVID が対照群よりも Dox 群で有意に高いことを示し、心室腔径の拡大とブレビスカピン治療がこれらの変化を大幅に軽減できることを示唆しています。これらの結果は、ブレビスカピンが心臓の代謝を再構築し、心臓のグルコース取り込みを増加させ、心臓の脂肪症を軽減し、ドキソルビシン誘発性の心臓機能不全と心筋形態の変化を軽減できることを示唆しています。

ブレビスカピンは、末梢血清レベルと心筋AKT発現を調節することにより、心臓のグルコースと脂質の代謝をリモデリングします。

次に、ブレビスカピンが糖と脂肪の代謝バランスをどのように調節するかを研究しました。に示すように 図4E、ブレビスカピンで治療したマウスの末梢血清中のセロトニンのレベルは、Dox で治療したマウスと比較して劇的に増加し、減少の程度はブレビスカピンの用量と直線関係を示し、95% 以上の減少は高用量群で観察されました。セロトニン (5-HT) は、神経系および非神経系でさまざまな機能を持つモノアミンです (オカティら、2019）。中枢神経系では、5-HT は気分や摂食行動を調節する神経伝達物質として機能します (バーガー他、2009）。最近の研究では、末梢の 5-HT が褐色脂肪組織における適応熱産生を阻害することにより、末梢組織の代謝調節に重要な役割を果たしていることが示されています。 5-HT 合成の阻害により、食事誘発性肥満マウス モデルにおける体重増加が減少し、代謝機能障害が改善されます (ゼムデグスら、2016; 夏他、2021）。ゲノムワイド関連研究により、セロトニン作動系と肥満との遺伝的関連性も明らかになりました。セロトニンはグルコース代謝に対して 2 つの異なる効果を持っています。1 つは膵臓 B 細胞のインスリン分泌を直接誘導し、血糖値を低下させることです。肝臓や骨格筋以外の組織による血液からのブドウ糖の取り込みを阻害し、血糖値を上昇させます（渡辺ほか、2011; カルミアンら、2019; ヤブトら、2019）。研究では、セロトニン治療が血糖値の突然の大幅な上昇につながる可能性があることを示していますが、セロトニンが血液からのグルコースの組織取り込みをどのように阻害するかはまだ不明です。私たちの実験結果は、ブレビスカピン治療後、心臓のグルコース摂取量の増加に対応して、末梢セロトニンレベルが急激に減少したことを示しました（図4E）、肝臓のグルコース摂取量は大きく変化しませんでした（補足図S2）、空腹時血糖値（FBG）レベルが低下しました（図4A）。ブレビスカピン群では、5-HT を追加投与すると、マウスのセロトニンレベルが増加し、心臓のグルコース取り込みが減少しました (図4B）。セロトニンが心筋細胞の代謝をどのように調節するかをさらに解析するために、Dox 誘発心筋損傷モデルマウスに 5-HT を追加してセロトニンレベルを上昇させ、トランスクリプトーム解析のためにマウスの心臓を収集しました。結果は、Dox と 5-HT で治療したグループの脂肪酸の酸化が、Dox 単独グループよりも有意に高いことを示しました (補足図S3）。次に、我々は、グルコース取り込みの調節に重要な役割を果たす心筋グルコース代謝の重要な調節因子であるPI3KプロテインキナーゼB（Akt/PKB）経路の変化を分析した。細胞の分裂、増殖、生存を促進します。そしてアポトーシスを阻害します。結果は、5-HT の添加が Akt の遺伝子発現を直接阻害するが、PI3K 触媒サブユニットまたは調節サブユニットのレベルには有意な変化は生じないことを示しました (図4C）。 AKT が失われると、心筋細胞のグルコース代謝能力が低下します。これらの結果は、ブレビスカピンがセロトニンのレベルを大幅に低下させることで組織のグルコース取り込みに対するセロトニンの阻害効果を緩和し、病的状態下で血液からのグルコースの吸収を確実にすることを示唆しており、身体が心臓代謝の調節に関与している可能性を明らかにしています。神経伝達物質を介したリモデリング。さらに重要なことは、中国で一般的に使用されている心臓血管薬であるブレビスカピンは、末梢セロトニンレベルを90%以上低下させることができ、心筋のグルコース代謝によって誘発される心筋肥大および心不全の治療において、古典的なセロトニン再取り込み阻害剤であるフルオキセチンよりも強力な効果を発揮することです。障害および糖尿病を治療するための、Dox 誘発性心毒性の新しい安全な治療薬です。疫学研究では、糖尿病が Dox 誘発性心毒性のリスクを高めることも示しています。したがって、この研究は、糖尿病と癌の患者に対する潜在的な治療戦略を提供します（チャン他、2021).

これらの発見に基づいて、ブレビスカピンがどのようにグルコースを調節するかを調査しました。心からの活用。その結果、ブレビスカピン介入後、Dox 曝露マウスにおける PI3K タンパク質発現が有意に減少し、心臓組織における PI3K タンパク質発現レベルが有意に増加したことが示されました。興味深いことに、AKT 発現は対照群と Dox 曝露群の両方で低レベルに維持され、ブレビスカピン治療後に AKT 発現の有意な増加が観察されました (図4D）。以前の研究では、AKTが細胞内のグルコース代謝を刺激し、グルコースをD-グルコース6-リン酸に変換することが示されています。 経由 解糖またはグリコーゲンへの重合のためのヘキソキナーゼ。私たちの結果は、ブレビスカピンが心筋AKTの発現を促進した後、グルコース代謝に関連するD-グルコース6-リン酸およびα-ケトグルタル酸レベルが有意に増加したことを示しました。図4F、G）、ブレビスカピンがAKTを介してグルコースをエネルギー源として使用する心筋の能力を高め、グルコース異化を促進したことを示唆しています。これまでの研究では、PI3K-Akt発現の増加が末梢組織での糖利用を促進し、インスリン抵抗性を低下させ、心臓のエネルギー供給を強化し、心不全を予防できる一方、PI3K-Akt経路の阻害は心臓細胞の生理活性に影響を与えることが報告されている（朱他、2013）。これらの結果は、ブレビスカピンがPI3K-Akt経路の活性化を調節することにより、Dox誘発性心筋損傷に対する耐性を強化することを示唆しています。これらの結果は、ブレビスカピンがセロトニンを阻害することにより血糖値を調節し、心筋におけるグルコース利用の制限を遮断し、PI3K-Akt経路を活性化することにより心筋におけるグルコース代謝を促進することを示唆している。したがって、セロトニンは心臓の糖脂質代謝を調節するための重要な標的である可能性があります。次に、心筋糖脂質代謝のリモデリング後の心機能と恒常性の変化を分析しました。 Dox モデル群と比較して、ブレビスカピン治療群の心筋 ATP 産生は有意に増加しました (図5A)、一方、ROS および FAO の代謝産物である MDA のレベルは大幅に減少しました (図5B、E）。 O2K エネルギー代謝分析により、ブレビスカピンが Dox 曝露によって引き起こされる心臓酸素消費量の劇的な増加を抑制することが示されました (図5C）、ATP生成/酸素消費比が大幅に減少しました（図5D)、ミトコンドリア膜電位を正規化しました (補足図S4）。これは、ブレビスカピン治療が、エネルギー効率の高いグルコースをエネルギー源として使用する心筋の能力を高めることを示唆しています。 ATP生産の効率を向上させます。心臓の負荷、酸化ストレス、心筋の酸素消費量を軽減します。結論として、ブレビスカピンは、セロトニン-血糖-心筋AKTループを調節し、心筋エネルギー代謝を改造し、グルコース利用を増加させ、FAOを減少させることにより、Dox曝露によって引き起こされる心臓内の高い酸素消費率と不適切な脂質燃焼の悪循環を効果的に断ち切ることができます。 (図5F）、DICのさらなる進行を防ぎます。

ブレビスカピンは、PINK1/Parkin シグナル伝達経路を通じて、Dox 治療後にミトコンドリア損傷を除去し、心筋恒常性を回復します。

DIC のメカニズムに関する仮説は過去数十年にわたって変化してきましたが、DIC の主な特徴は酸化還元不均衡とミトコンドリア機能の障害です。この結果は、心臓エネルギー比とエネルギー出力効率の観点からDIC発症の以前の仮説を改善することを妨げたが、重要な疑問、すなわちミトコンドリア後の心臓の代謝ネットワークを最適化することでブレビスカピンがどのようにして効率的なエネルギー産生と心臓微小環境恒常性を達成するのかという重要な疑問を提起した。けが。そこで、私たちはこの質問に答えることを目指しました。 Pten 誘導性の推定キナーゼ 1 PINK1/Parkin シグナル伝達経路は、ミトコンドリアのオートファジーによって媒介される主要な経路の 1 つであり、心筋細胞のエネルギー代謝の維持に重要な役割を果たしています (デワンジーほか、2021）。心筋細胞のミトコンドリアが損傷すると、ミトコンドリアの品質管理システムの「番兵」であるPINK1がミトコンドリアの外膜に蓄積し、パーキンを集めてリン酸化します（プールとマクラウド、2021）。活性化されたParkinは損傷したミトコンドリアをユビキチン化し、その後リソソームと融合して完全に分解します。 PINK1/Parkin シグナル伝達経路によって媒介されるミトコンドリアのオートファジーの強化は、心筋細胞のミトコンドリアの恒常性を維持し、心臓病の進行を遅らせることができます (ドーン、2016).

したがって、ブレビスカピンはPINK1/パーキン経路を通じてミトコンドリアのオートファジーを強化し、心筋細胞のミトコンドリアの恒常性を維持すると推測しました。 WBは、Doxグループと比較して、ブレビスカピン治療グループのPINK1/Parkinの総タンパク質発現レベルが有意に増加していることを示しました（図6A)、対応するリン酸化レベルも大幅に増加しました (図6B）。 Dox 治療グループでは、PINK1/Parkin タンパク質の発現が減少傾向を示し、タンパク質のリン酸化が大幅に減少する一方で、ミトコンドリア膜タンパク質 Tom20 のレベルが増加しました。これは、Dox がミトコンドリア損傷を誘発したにもかかわらず、損傷したミトコンドリアの適時の除去を阻害したことを示唆しています。ミトコンドリア。 Dox グループでは、多数の壊れて損傷したミトコンドリアが観察されました (赤い矢印、 図6D)、一方、Brev グループでは大量のリソソームに包まれたミトコンドリア オートファジーが観察されました (青い矢印)。 Dox と Brev を同時に適用した場合、ミトコンドリアの隆起は明白で、ミトコンドリアの形態は正常で、膜構造は無傷でした。 MitoTracker で染色すると、Dox グループで最も高い蛍光強度が見つかりました (図6C）、Dox グループにはコントロールおよび Brev グループよりも有意に多くのミトコンドリアがあったことを示しています。さらに、抗酸化タンパク質 NADH および SOD のレベルは、Brev 治療後に大幅に増加しました (補足図S5）。エネルギー受容体AMPKのリン酸化は、Doxグループと比較してBrev治療グループで大幅に減少しましたが、細胞増殖制御中枢は活性化されました（図6E）。これらの結果は、Dox 曝露が心筋損傷、ミトコンドリア蓄積、恒常性不均衡を引き起こすことを示しており、これは Dox 投与後に心臓エネルギー出力効率が低下し、酸化ストレスが増加する理由をある程度説明します。ブレビスカピンは、ミトコンドリアのオートファジーを促進し、損傷したミトコンドリアを除去し、心筋の恒常性を回復し、心臓 ATP 産生と酸化ストレスの間の動的なバランスを効果的に確保します。

ブレビスカピンのこの効果が Mdivi-1 によってブロックされると、心筋細胞の ROS レベルが大幅に増加しました (図6F)、一方、ATP 生産は大幅に減少しました (図6G）。さらに、心筋細胞の生存率も低下しました（補足図S6）、心筋細胞に対するブレビスカピンの修復効果は阻害されました。 Dox と Mdivi-1 を組み合わせると、ATP 産生と心筋細胞の生存率がさらに低下し、ROS レベルが上昇し、心筋損傷が悪化しました。これらの結果は、ミトコンドリア オートファジーが Dox 誘発性心筋細胞傷害において重要な役割を果たしているということを示唆しています。心臓の代謝ネットワークの再構築だけでは、ミトコンドリア損傷によって引き起こされる機能不全を完全に相殺することはできず、ブレビスカピンの心筋保護効果は、グルコースおよび脂質代謝の調節とミトコンドリアのオートファジーの活性化に依存します。これは、心臓代謝ネットワークの調節が DIC 発症の仮説に関して考慮されていない理由でもあるかもしれません。 Dox によって引き起こされる心機能不全および心不全の症状の治療においては、病気の進行の予防と心機能の回復が同様に重要であるはずであり、その方が患者の予後と生活の質にとってより有益であることが示唆されています。

著者らは、草案の作成とデータのキュレーションについて、中国の青島大学付属病院癌研究所である W-SS に感謝します。