La breviscapina remodela el metabolismo de la glucosa y los lípidos del miocardio mediante la regulación de la serotonina para aliviar la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina

reactivos

Se utilizaron los siguientes reactivos: DMEM, FBS, penicilina/estreptomicina (Meilunbio, Dalian, China), kits cTnI Elisa (Sangon Biotech, Shanghai, China), kits TNF-α, IL-1β e IL-6 Elisa (MyBioSource, San Diego, Estados Unidos), kits de MDA, kits de SOD y kits de NADH (Solarbio, Beijing, China), kits de CCK-8 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), kits de fluorimetría de ROS, tinte fluorescente JC-1, kits de extracción de proteínas y kits BCA (Meilunbio, Dalian, China). IL-1 (1:100), PINK1(1:1.000), Parkin (1:1.000), AMPK(1:1.000), Akt (1:1.000), P13K(1:1.000), Tom20 (1:1.000) , β-tubulina (1:1000), mTOR (1:1000) y un anticuerpo GAPDH conjugado con HRP (1:1000) se obtuvieron de Abclonal Biotechnology (Wuhan, China). El tampón de lisis RIPA y el tampón de carga se adquirieron en Meilunbio (Dalian, China). Las membranas de PVDF se obtuvieron de Merck (Nueva Jersey, Estados Unidos). DMSO se adquirió de Macklin (Shanghai, China), y doxorrubicina, breviscapina y dexrazoxano se adquirieron de Widely (Wuhan, China). El inhibidor Mdivi-1 se adquirió de Selleck Chemicals (Houston, Estados Unidos).

Condiciones de cultivo celular y líneas celulares.

El medio de cultivo y los suplementos para el cultivo celular se adquirieron en Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, Estados Unidos), y los materiales de plástico se adquirieron en Corning (Corning, NY, Estados Unidos). Se cultivaron células de cardiomioblasto embrionario de rata H9c2 derivadas de corazón de rata (ATCC, CRL-1446) en DMEM que contenía suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (37°C, 5% CO₂). Se cultivaron células de cáncer de mama metastásico humano MCF-7 (iCell, iCell-h129) en 1.640 medios suplementados con suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina. Se cultivaron células de cáncer de mama de ratón 4T1 (ATCC, FS-0158) en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina.

Las células se pasaron regularmente cuando alcanzaron la confluencia 80–90% y se sembraron en placas de 96 pocillos (1 × 10⁴ células/pozo). Las células H9c2 se expusieron al control, Dox 5 μM (Guo y otros, 2013), Dox 5 µM + Dexra 20 µM (Sangweni y otros, 2020), o 5 μM Dox+200 μM breviscapina (Li y otros, 2022) durante 24 h, respectivamente. Las células tratadas solo con DMEM se usaron como controles en blanco y se usó Dexra como control positivo. Finalmente, también inyectamos Mdivi-1 (5μM, en DMSO), un inhibidor de la división mitocondrial (Nhu y otros, 2021).

Evaluación del estrés oxidativo.

Los niveles de ROS intracelulares se midieron utilizando el colorante fluorescente DCFH-DA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se preparó una solución DCFH-DA (1 μM) en PBS y se añadió a células H9c2 cultivadas en una placa de 6 pocillos antes de la incubación a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS. Se tomaron fotomicrografías fluorescentes con un aumento de 20 × utilizando un microscopio de fluorescencia de Leica Microsystems, Ltd. Los niveles de ROS se cuantificaron con un citómetro de flujo Beckman (Beckman, California, Estados Unidos).

Determinación de índices enzimáticos.

La actividad de SOD y NADH se midió utilizando un kit de ensayo de actividad según las instrucciones del fabricante. La absorbancia y la luminiscencia se midieron utilizando un lector de microplacas (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Microscopio de electrones

Las células se fijaron con fijador de glutaraldehído 0,51 TP3T a 4 ° C durante 15 a 30 minutos y se recogieron mediante centrifugación a 10.000 a 13.000 rpm durante 5 minutos. Las células se fijaron adicionalmente con glutaraldehído 3% a 4 °C durante la noche y luego se trataron con tetróxido de osmio 1% a temperatura ambiente durante 2 h. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en un gradiente de acetona, se incluyeron en Epon 812, se sometieron a posicionamiento óptico y se cortaron en secciones ultrafinas. Las secciones se tiñeron doblemente con acetato de uranilo y citrato de plomo. La ultraestructura mitocondrial se examinó utilizando un microscopio electrónico de transmisión H-7650 (Hitachi, Toyko, Japón).

Determinación de la respiración mitocondrial.

Aproximadamente 10⁶ Se utilizaron células para medir la respiración mitocondrial con un respirómetro O2K (Oroboros Instruments, Austria). La concentración de oxígeno se determinó y analizó utilizando el software Oroboros DatLab 7.4. En resumen, se registró un estado respiratorio de fuga solo en las células, la transferencia de electrones se acopló a la fosforilación mediante la adición de ADP 5 mM y se registró la respiración del estado 3 respaldada por el complejo I. La respiración en el estado máximo 3 con entrada de electrones paralela desde el complejo I y el complejo II se registró mediante la adición de succinato 10 mM, y la respiración asistida por el complejo II se midió en presencia de rotenona 6,25 µM. La capacidad máxima de transferencia de electrones se registró en presencia de cianuro de carbonilo p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) 5 µM. Finalmente, se administró antimicina (Ama), que completa el complejo Ⅲ y bloquea todo el transporte de electrones, y la tasa de consumo de oxígeno se midió como consumo de oxígeno no mitocondrial.

Determinación de cambios en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

Se utilizó tinción con yoduro de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbocianina (JC-1) para evaluar el potencial de membrana mitocondrial en células H9c2. Brevemente, de acuerdo con las condiciones experimentales predeterminadas, las células H9c2 se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) tibia antes de teñirlas con 100 μl de solución JC-1 2 μM (mezclada en DMEM sin rojo de fenol) y se incubaron en cultivo celular estándar. condiciones durante 30 min en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS tibio y se tomaron fotomicrografías de fluorescencia con un aumento de 20X utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Leica Microsystems CMS GmbH (Leica Camera AG, Barnack, Alemania).

inmunofluorescencia

Para evaluar la localización mitocondrial, las células cultivadas en cubreobjetos se lavaron con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído 4% durante 15 minutos. Luego, las células se permeabilizaron con Triton X-100 0,5% durante 20 min y se bloquearon con suero de cabra 5% durante 30 min. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y con anticuerpos secundarios durante 1 h. Después de lavar tres veces, las células se tiñeron con 4′-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y se tomaron imágenes con un microscopio de barrido láser confocal.

Medición de ATP

Además, la concentración de ATP intracelular se midió utilizando un kit de ensayo de ATP siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se lisaron en el tampón de lisis mediante pipeteo repetido y se centrifugaron a 4 °C y 13.000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se utilizaron para el análisis de los niveles de ATP y las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el ensayo BCA. Se añadió un volumen de cincuenta microlitros de sobrenadante a 100 µl de solución de detección de ATP, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, se mezcló inmediatamente y se determinó la luminiscencia utilizando un luminómetro (Flex Station 3). La concentración de ATP se calculó según una curva estándar y se convirtió en nmol/μg de proteína.

transferencia Western

La expresión de proteínas se evaluó mediante transferencia Western y se cuantificó con densitometría. Las células H9c2 tratadas con Dox y Dox + Brev en placas de cultivo celular de 10 cm se lisaron con el tampón de lisis RIPA. Tomando 5 mg de tejido y añadiendo 10 ml de tampón de lisis. Se utilizó el método Bradford para medir la concentración de proteína, utilizando BSA como estándar. Se mezclaron cantidades equivalentes de proteínas con tampón de carga (5X) y se hirvieron a 95°C durante 5 min. Luego, las proteínas se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS 10%-12% (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con leche 5% en TBST durante 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos específicos, como GAPDH policlonal de conejo. El análisis WB de la expresión y fosforilación de proteínas se realizó utilizando anticuerpos contra AMPK, Parkin, PINK1, Akt, PI3K, Tom20 y GAPDH como control interno. Las señales específicas se visualizaron utilizando el sistema Bio-Rad gel doc (Bio-Rad Laboratories, California, Estados Unidos). Los datos se presentan como la media ± DE (norte = 3) y cuantificado mediante análisis ImageJ.

La cría de animales

En los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de ocho semanas de edad (SiPeiFu, Beijing, China). Los animales se alojaron en jaulas y en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad a 50% de humedad y 25°C ± 2°C. Los animales tuvieron libre acceso a una dieta estándar en pellets y agua. El plasma se obtuvo por centrifugación a 200 g durante 10 minutos a 4 °C y se mantuvo a -80 °C antes de la extracción.

La investigación se ajusta a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (Publicación NIH No. 85–23, revisada en 1985).

Protocolos de experimentación con animales.

Los ratones fueron asignados aleatoriamente a seis grupos de tratamiento, incluido un grupo de control, un grupo modelo (grupo Dox), grupos de tres dosis de Dox + Brev y un grupo de Dox + Dexra.

Para imitar los regímenes terapéuticos humanos, se administró una dosis acumulativa de 12 mg/kg de Dox. a través de tres inyecciones ip semanales (4 mg/kg los días 0, 7 y 14) excepto para el grupo de control.

Para investigar el efecto de Brev en vivo, los ratones fueron tratados con Brev, seguido de una inyección ip diaria de 4,8 y 16 mg/kg de Brev durante 3 semanas, y los ratones en el grupo de tratamiento con Dox + Dexra recibieron 12 mg/kg de Dexra mediante inyección intraperitoneal durante 3 semanas además de Dox. tratamiento. (Alexandre et al., 2020). Brev y Dexra fueron tratados después de las inyecciones de Dox. La supervivencia se controló diariamente y la función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía, 3 semanas después de la primera inyección de Dox (Li y otros, 2018).

Al grupo de control se le inyectó el mismo volumen de solución salina normal. Los ratones fueron sacrificados 1 semana después de la administración de Dox.

Estudios de tumores

A los ratones se les inyectó por vía subcutánea 1×10⁵ Células tumorales de mama 4T1. Una semana después de la inyección de células, cuando el diámetro medio de los tumores era superior a 2 mm, los ratones fueron tratados con Dox o breviscapina como se describió anteriormente. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana durante un máximo de 4 semanas y los volúmenes del tumor se calcularon con la siguiente ecuación: V = 4π/3×(L/2)2× (W/2), donde V, L y W representan el volumen, longitud y ancho del tumor, respectivamente.

¹⁸Imágenes PET/CT con F-fluorodesoxiglucosa

Se anestesiaron ratones del grupo Dox y breviscapina (en ayunas durante la noche) con isoflurano 2% y se les inyectó aproximadamente 11 MBq/0,2 ml de PET con fluorodesoxiglucosa (FDG). a través de una vena de la cola y luego regresaron a sus jaulas. Cuarenta minutos más tarde, los ratones fueron anestesiados nuevamente con isoflurano 2% y colocados en una cama estereotáxica en un microPET Focus 220 (Siemens Company, Berlín, Alemania). Luego se inició una exploración PET estática de 20 minutos. Posteriormente, se tomaron imágenes de los ratones en un microCAT II (Siemens Company, Berlín, Alemania) con una intensidad del haz de rayos X de 180 mA y un voltaje del tubo de rayos X de 80 kVp para el registro conjunto anatómico con las imágenes PET.

Pacientes

Tras más de 4 h de ayuno y controlando que la glucemia fuera inferior a 120 mg/dl, todos los pacientes recibieron una administración intravenosa de ¹⁸F-FDG (5,5 MBq/kg). Las exploraciones PET/CT se iniciaron 60 minutos después de la inyección utilizando una biografía combinada PET/CT (Siemens Company, Berlín, Alemania). Todas las exploraciones se realizaron en un modelo tridimensional. Primero se obtuvo una tomografía computarizada de dosis baja para corrección de atenuación y correlación anatómica. La autorización ética se ajusta a la Guía para el documento de aprobación del comité de ética publicada por el Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao (QDU-HEC-2022057).

Análisis de la función cardíaca e histopatología.

El tejido cardíaco de ratón de cada grupo se almacenó en paraformaldehído 4%, se embebió en cera de parafina y se cortó en serie en secciones de 4 mm. Se desparafinaron secciones de tejido. a través de inmersión en xileno (3 veces, durante 5 min cada una) y rehidratación utilizando una serie descendente de alcoholes (alcohol 100%, 90%, 85% y 75%, 5 min cada uno). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina para análisis histológico. Las muestras de biopsia se tiñeron con tinción tricrómica de Masson para investigar cualquier cambio morfológico y fibrótico en el corazón. La tinción azul representó acumulación de colágeno. La inmunohistoquímica se realizó utilizando los kits de tinción Histone Simple (Nichirei, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se trataron durante 15 minutos con 3% H2O2 en metanol para inactivar las peroxidasas endógenas y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con los anticuerpos primarios IL-1, 1:100. Luego se observó la ultraestructura con un aumento de 20X utilizando un microscopio de fluorescencia invertida CMS GmbH de Leica Microsystems (Leica Camera AG, Barnack, Alemania).

Medición de los niveles de glucosa.

Los ratones se mantuvieron con una dieta normal. El día de la experimentación, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 h (comenzando a las 8 am) y se extrajo sangre. a través de la vena de la cola para la medición de los niveles de glucosa.

Se lavaron células de cardiomioblastos de rata H9c2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se centrifugaron y se trituraron ultrasónicamente, y se incubaron en condiciones estándar de cultivo celular durante 10 minutos. Después de la incubación, se midió la absorbancia utilizando un lector de microplacas (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Los tejidos de ratón se lisaron con el tampón de lisis. Las muestras se sonicaron con un homogeneizador Qsonica usando pulsos de 30 Hz durante 20 segundos y luego se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió, se distribuyó en alícuotas en viales de 200 µl y se almacenó a -80 °C. Las concentraciones de proteínas de las muestras se cuantificaron mediante el ensayo BCA. Las muestras se analizaron utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para TNF-α, IL-1β e IL-6 según el protocolo del fabricante. La densidad óptica se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas VICTOR Nivo™ (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Determinación de cambios en el metaboloma del ratón.

Las muestras de sangre se resuspendieron, se incubaron en hielo, se centrifugaron, se diluyeron hasta la concentración final y se centrifugaron. Finalmente, el sobrenadante se inyectó en el sistema LC-MS/MS para su análisis. Los análisis UHPLC-MS/MS se realizaron utilizando un sistema Vanquish UHPLC (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos) junto con un Orbitrap Q Exactive.^MT Espectrómetro de masas HF (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos). Los metabolitos identificados se anotaron utilizando la base de datos KEGG, la base de datos HMDB y la base de datos LIPID Maps. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parcial (PLS-DA) se realizaron utilizando metaX. Se aplicó análisis univariado (t-prueba) para calcular la significación estadística (pag-valor). Metabolitos con un VIP>1, pag un valor <0,05 y un cambio en veces ≥2 o ≤0,5 se consideraron metabolitos diferencialmente abundantes.

Las antraciclinas aumentan el consumo de oxígeno del miocardio y disminuyen la tasa de producción de ATP.

Curiosamente, esta compensación metabólica aumentó los niveles de ROS en el miocardio, lo que llevó a un mayor estrés oxidativo.Figura 2A). El análisis del metabolismo energético de O2K mostró que Dox aumentó el consumo de oxígeno del miocardio (Figura 2B) y condujo a la hiperpolarización de la membrana mitocondrial (Figura 2C) (esto también es un signo de niveles elevados de estrés oxidativo mitocondrial y se observa a menudo en modelos de isquemia-reperfusión cardíaca). La tinción con JC-1 también mostró que la exposición a Dox provocó un aumento en el potencial de membrana (intensidad de fluorescencia roja mejorada) en algunas células supervivientes (Figura 2D). Aunque en el corazón se produjeron procesos compensatorios como el aumento del consumo de oxígeno y la oxidación de lípidos, desafortunadamente la tasa de producción de ATP en el miocardio se redujo drásticamente en respuesta a la reducción del metabolismo de la glucosa.Figura 2E). La comparación de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de producción de ATP mostró que la exposición a Dox condujo al consumo de una gran cantidad de oxígeno por parte del miocardio pero a la producción de solo una pequeña cantidad de ATP (Figura 2F), aumentando considerablemente la carga sobre el corazón. Este déficit en la producción de energía provocó un aumento significativo en el nivel del receptor de energía AMPK en el grupo Dox (Figura 2G). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el corazón exhibe una alta tasa de consumo de oxígeno y una baja tasa de producción de ATP en respuesta al deterioro del metabolismo de la glucosa causado por las antraciclinas y que este fenómeno no satisface completamente los requisitos energéticos del miocardio pero conduce a un estrés oxidativo excesivo. Por lo tanto, se especula que en respuesta a la brecha energética, la oxidación de lípidos en el corazón aumenta y se acumula más ROS, y esta vía de retroalimentación deficiente puede ser un factor importante de la CID.

El nuevo agente cardioprotector breviscapina promueve el metabolismo de la glucosa cardíaca e inhibe la miocardiopatía inducida por Dox

Inspirándonos en los resultados antes mencionados, investigamos el efecto protector del flavonoide breviscapina, utilizado para tratar enfermedades cardiovasculares, contra la progresión de la CID desde una perspectiva metabólica. El protocolo experimental se muestra en Figura 3A, y ¹⁸Las imágenes PET/CT con F-FDG se realizaron en ratones 1 semana después de la primera inyección de doxorrubicina. Como se muestra en Figura 3B, la captación cardíaca fue significativamente mayor en el grupo tratado con breviscapina que en el grupo tratado con Dox solo, lo que sugiere que la intervención con breviscapina podría revertir la disminución inducida por Dox en el metabolismo de la glucosa cardíaca y remodelar el metabolismo energético cardíaco. A continuación se examinaron la función cardíaca y los cambios patológicos después del tratamiento con breviscapina y se utilizó el fármaco clínico dexrazoxano (Dexra) como control positivo. La ecocardiografía en Figura 3C mostró que LVEF y LVFS en el grupo Dox fueron significativamente más bajos que los del grupo de control, y LVESV y LVD fueron significativamente más altos que los del grupo de control. Estos resultados sugieren que la función sistólica del ventrículo izquierdo de los ratones disminuyó después del tratamiento con Dox, y que la lesión miocárdica inducida por Dox en este estudio fue similar a la miocardiopatía dilatada. Dox redujo la función sistólica, que es similar a lo que se ha informado anteriormente (Venturini y otros, 1996; Sol y otros, 2022). Todas las funciones se restauraron en los corazones de los animales tratados con Brev y Dox en comparación con los de los animales tratados sólo con doxorrubicina. La cTnI es un biomarcador de lesión miocárdica (Solaro y Solaro, 2020). La concentración de cTnI aumentó significativamente en los ratones tratados con doxorrubicina sola en comparación con los del grupo control, y diferentes concentraciones de Brev mostraron mejores efectos (Figura 3D). Además, la tinción de tejidos cardíacos patológicos después de diferentes tratamientos mostró que la estructura del tejido cardíaco en ratones del grupo de control era normal. A diferencia de los del grupo de control, los ratones del grupo Dox exhibieron una gran cantidad de lesiones cardíacas, incluyendo necrosis, edema intracelular, trastorno y rotura miofibrilar y degeneración ondulada de las fibras cardíacas. Curiosamente, el preacondicionamiento con breviscapina previno este tipo de lesión, alivió la acumulación excesiva de lípidos cardíacos y restableció la homeostasis miocárdica.Figura 3F). La tinción de Masson del miocardio mostró que la fibrosis intersticial aumentó significativamente después del tratamiento con Dox y que la intervención de Brev redujo el grado de fibrosis cardíaca (Figura 3E). Los datos de la ecografía cardíaca mostraron que LVESV y LVID fueron significativamente mayores en el grupo de Dox que en el grupo de control, lo que sugiere un agrandamiento del diámetro de la cavidad ventricular y que el tratamiento con breviscapina podría aliviar significativamente estos cambios. Estos resultados sugieren que la breviscapina puede remodelar el metabolismo cardíaco, aumentar la captación de glucosa cardíaca, reducir la esteatosis cardíaca y aliviar la disfunción cardíaca inducida por la doxorrubicina y los cambios en la morfología del miocardio.

La breviscapina remodela el metabolismo cardíaco de la glucosa y los lípidos mediante la regulación de los niveles séricos periféricos y la expresión de AKT en el miocardio.

A continuación, estudiamos cómo la breviscapina regula el equilibrio del metabolismo del azúcar y las grasas. Como se muestra en Figura 4E, el nivel de serotonina en el suero periférico en ratones tratados con breviscapina aumentó dramáticamente en comparación con el de los ratones tratados con Dox, y el grado de disminución mostró una relación lineal con la dosis de breviscapina, siendo una disminución de más de 95%. observado en el grupo de dosis alta. La serotonina (5-HT) es una monoamina que tiene una variedad de funciones en los sistemas neuronales y no neuronales (Okaty y otros, 2019). En el sistema nervioso central, la 5-HT actúa como un neurotransmisor que regula el estado de ánimo y la conducta alimentaria.Berger y otros, 2009). Estudios recientes han demostrado que la 5-HT periférica desempeña un papel importante en la regulación metabólica de los tejidos periféricos al inhibir la termogénesis adaptativa en el tejido adiposo marrón. La inhibición de la síntesis de 5-HT reduce el aumento de peso y mejora la disfunción metabólica en un modelo de ratón con obesidad inducida por la dieta (Zemdegs et al., 2016; Xia y otros, 2021). Los estudios de asociación de todo el genoma también han revelado un vínculo genético entre el sistema serotoninérgico y la obesidad. La serotonina tiene dos efectos diferentes sobre el metabolismo de la glucosa: induce directamente la secreción de insulina en las células B pancreáticas, lo que reduce los niveles de glucosa en sangre; e inhibe la absorción de glucosa de la sangre por tejidos distintos del hígado y el músculo esquelético, elevando los niveles de azúcar en sangre (Watanabe y otros, 2011; Carmean y otros, 2019; Yabut et al., 2019). Los estudios han demostrado que el tratamiento con serotonina puede provocar un aumento repentino y grande de los niveles de glucosa en sangre, pero aún no está claro cómo la serotonina inhibe la absorción tisular de glucosa de la sangre. Nuestros resultados experimentales mostraron que después del tratamiento con breviscapina, los niveles periféricos de serotonina disminuyeron drásticamente, lo que corresponde a un aumento en la ingesta cardíaca de glucosa (Figura 4E), mientras que la ingesta de glucosa en el hígado no cambió significativamente (Figura complementaria S2) y los niveles de glucosa en ayunas (FBG) disminuyeron (Figura 4A). En el grupo de breviscapina, la suplementación adicional con 5-HT aumentó el nivel de serotonina en ratones y disminuyó la captación cardíaca de glucosa (Figura 4B). Para analizar más a fondo cómo la serotonina regula el metabolismo de los cardiomiocitos, agregamos 5-HT adicional para aumentar los niveles de serotonina en ratones modelo de lesión miocárdica inducida por Dox y luego recolectamos los corazones de los ratones para el análisis del transcriptoma. Los resultados mostraron que la oxidación de los ácidos grasos en el grupo tratado con Dox y 5-HT fue significativamente mayor que en el grupo de Dox solo (Figura complementaria S3). Luego analizamos los cambios en la vía PI3K-proteína quinasa B (Akt/PKB), un importante regulador del metabolismo de la glucosa miocárdica que desempeña un papel importante en la regulación de la absorción de glucosa; promover la división, proliferación y supervivencia celular; e inhibir la apoptosis. Los resultados mostraron que la adición de 5-HT inhibió directamente la expresión génica de Akt pero no cambió significativamente la subunidad catalítica PI3K ni el nivel de la subunidad reguladora (Figura 4C). La pérdida de AKT reduce la capacidad de los cardiomiocitos para metabolizar la glucosa. Estos resultados sugieren que la breviscapina alivia el efecto inhibidor de la serotonina sobre la captación de glucosa en los tejidos al reducir significativamente el nivel de serotonina y asegura la absorción de glucosa de la sangre en condiciones patológicas, revelando la posibilidad de que el cuerpo pueda participar en la regulación del metabolismo cardíaco. remodelación a través de neurotransmisores. Más importante aún, la breviscapina, como fármaco cardiovascular de uso común en China, puede reducir los niveles periféricos de serotonina en más de 90% y tiene un efecto más potente que el clásico inhibidor de la recaptación de serotonina fluoxetina en el tratamiento de la hipertrofia miocárdica y la insuficiencia cardíaca inducida por el metabolismo de la glucosa miocárdica. trastorno y diabetes, lo que representa un nuevo agente seguro para el tratamiento de la cardiotoxicidad inducida por Dox. Los estudios epidemiológicos también han demostrado que la diabetes aumenta el riesgo de cardiotoxicidad inducida por Dox; por lo tanto, este estudio proporciona una posible estrategia de tratamiento para pacientes con diabetes y cáncer (Chang y otros, 2021).

Con base en estos hallazgos, investigamos cómo la breviscapina regula la glucosa. Utilización por el corazón. Los resultados mostraron que la expresión de la proteína PI3K en ratones expuestos a Dox disminuyó significativamente y que el nivel de expresión de la proteína PI3K en el tejido cardíaco aumentó significativamente después de la intervención con breviscapina. Curiosamente, la expresión de AKT se mantuvo en niveles bajos tanto en el grupo control como en el grupo expuesto a Dox, y se observó un aumento significativo de la expresión de AKT después del tratamiento con breviscapina (Figura 4D). Estudios anteriores han demostrado que AKT estimula el metabolismo de la glucosa en las células, convirtiendo la glucosa en D-glucosa 6-fosfato a través de hexoquinasa para la glucólisis o polimerización a glucógeno. Nuestros resultados mostraron que después de que la breviscapina promoviera la expresión de AKT miocárdico, los niveles de D-glucosa 6-fosfato y ácido α-cetoglutárico relacionados con el metabolismo de la glucosa aumentaron significativamente (Figura 4F, G), lo que sugiere que la breviscapina mejoró la capacidad del miocardio para utilizar la glucosa como fuente de energía a través de AKT y promovió el catabolismo de la glucosa. Estudios anteriores han informado que el aumento de la expresión de PI3K-Akt puede promover la utilización del azúcar en los tejidos periféricos, reducir la resistencia a la insulina, mejorar el suministro de energía cardíaca y prevenir la insuficiencia cardíaca, mientras que la inhibición de la vía PI3K-Akt afecta las actividades fisiológicas de las células cardíacas (Zhu y otros, 2013). Estos resultados sugieren que la breviscapina mejora la resistencia a la lesión miocárdica inducida por Dox al modular la activación de la vía PI3K-Akt. Estos resultados sugieren que la breviscapina regula los niveles de glucosa en sangre mediante la inhibición de la serotonina, bloquea la restricción de la utilización de la glucosa en el miocardio y promueve el metabolismo de la glucosa en el miocardio mediante la activación de la vía PI3K-Akt. Por lo tanto, la serotonina puede ser un objetivo importante para regular el metabolismo de los glicolípidos cardíacos. Luego analizamos los cambios en la función cardíaca y la homeostasis después de la remodelación del metabolismo de los glicolípidos del miocardio. En comparación con el grupo del modelo Dox, la producción miocárdica de ATP en el grupo tratado con breviscapina aumentó significativamente (Figura 5A), mientras que los niveles de ROS y MDA, un metabolito de la FAO, disminuyeron significativamente (Figuras 5B,E). El análisis del metabolismo energético O2K mostró que la breviscapina inhibió el dramático aumento en el consumo cardíaco de oxígeno causado por la exposición a Dox (Figura 5C), disminuyó significativamente la relación producción de ATP/consumo de oxígeno (Figura 5D), y normalizó el potencial de membrana mitocondrial (Figura complementaria S4). Esto sugiere que el tratamiento con breviscapina aumenta la capacidad del miocardio para utilizar glucosa de alta eficiencia energética como fuente de energía; mejora la eficiencia de la producción de ATP; y reduce la carga cardíaca, el estrés oxidativo y el consumo de oxígeno del miocardio. En conclusión, la breviscapina puede romper eficazmente el círculo vicioso de una alta tasa de consumo de oxígeno y una combustión inadecuada de lípidos en el corazón causada por la exposición a Dox al regular el ciclo serotonina-glucemia-AKT miocárdico, remodelar el metabolismo energético del miocardio, aumentar la utilización de glucosa y reducir la FAO. (Figura 5F), impidiendo el desarrollo posterior de CID.

Breviscapina elimina el daño mitocondrial y restaura la homeostasis miocárdica después del tratamiento con Dox a través de la vía de señalización PINK1/Parkin

Aunque las hipótesis sobre los mecanismos de la CID han variado en las últimas décadas, las características clave de la CID son el desequilibrio redox y el deterioro de la función mitocondrial. Los resultados impidieron mejorar previamente la hipótesis del desarrollo de CID desde la perspectiva de la relación de energía cardíaca y la eficiencia de la producción de energía, pero plantean una pregunta clave, a saber, cómo la breviscapina logra una producción de energía eficiente y la homeostasis microambiental cardíaca optimizando la red metabólica en el corazón después de la mitocondria. lesión. Por lo tanto, nuestro objetivo era responder a esta pregunta. La supuesta vía de señalización PINK1/Parkin inducida por Pten es una de las principales vías mediadas por la autofagia mitocondrial y desempeña un papel importante en el mantenimiento del metabolismo energético de los cardiomiocitos.Dewanjee y otros, 2021). Cuando las mitocondrias de las células del miocardio se dañan, PINK1, como "centinela" del sistema de control de calidad mitocondrial, se acumula en la membrana externa de las mitocondrias y recolecta y fosforila Parkin (Poole y Macleod, 2021). El Parkin activado ubiquitina las mitocondrias dañadas, que luego se fusionan con los lisosomas para completar la degradación. La autofagia mitocondrial mejorada mediada por la vía de señalización PINK1/Parkin puede mantener la homeostasis mitocondrial en los cardiomiocitos y retardar la progresión de la enfermedad cardíaca.Dorn, 2016).

Por lo tanto, especulamos que la breviscapina mejora la autofagia mitocondrial a través de la vía PINK1/Parkin y mantiene la homeostasis mitocondrial en los cardiomiocitos. WB demostró que, en comparación con el grupo de Dox, el nivel de expresión de la proteína total de PINK1/Parkin en el grupo de tratamiento con breviscapina aumentó significativamente (Figura 6A), y el nivel de fosforilación correspondiente también aumentó significativamente (Figura 6B). En el grupo de tratamiento con Dox, la expresión de la proteína PINK1/Parkin mostró una tendencia decreciente y la fosforilación de proteínas disminuyó significativamente, mientras que el nivel de la proteína de la membrana mitocondrial Tom20 aumentó, lo que sugiere que aunque Dox indujo daño mitocondrial, inhibió la eliminación oportuna de las células dañadas. mitocondrias. Se observó una gran cantidad de mitocondrias rotas y dañadas en el grupo Dox (flecha roja, Figura 6D), mientras que en el grupo Brev se observó una gran cantidad de autofagia mitocondrial envuelta en lisosomas (flecha azul). Cuando se aplicaron Dox y Brev simultáneamente, la cresta mitocondrial era obvia, la morfología mitocondrial era normal y la estructura de la membrana estaba intacta. Al teñir con MitoTracker, la intensidad de fluorescencia más alta se encontró en el grupo Dox (Figura 6C), lo que indica que había significativamente más mitocondrias en el grupo Dox que en los grupos control y Brev. Además, los niveles de las proteínas antioxidantes NADH y SOD aumentaron significativamente después del tratamiento con Brev (Figura complementaria S5). La fosforilación del receptor de energía AMPK se redujo significativamente en el grupo de tratamiento con Brev en comparación con el grupo de Dox, mientras que los centros de control del crecimiento celular se activaron (Figura 6E). Estos resultados indican que la exposición a Dox causa daño miocárdico, acumulación mitocondrial y desequilibrio de la homeostasis, lo que hasta cierto punto explica por qué la eficiencia de la producción de energía cardíaca se reduce y el estrés oxidativo aumenta después de la administración de Dox. La breviscapina puede promover la autofagia mitocondrial, eliminar las mitocondrias dañadas y restaurar la homeostasis miocárdica, asegurando eficazmente el equilibrio dinámico entre la producción cardíaca de ATP y el estrés oxidativo.

Cuando Mdivi-1 bloqueó este efecto de la breviscapina, el nivel de ROS en los cardiomiocitos aumentó significativamente (Figura 6F), mientras que la producción de ATP disminuyó significativamente (Figura 6G). Además, la tasa de supervivencia de los cardiomiocitos disminuyó (Figura complementaria S6), y se inhibió el efecto reparador de la breviscapina sobre los cardiomiocitos. Cuando se combinaron Dox y Mdivi-1, la producción de ATP y la tasa de supervivencia de las células del miocardio se redujeron aún más, el nivel de ROS aumentó y la lesión del miocardio se agravó. Estos resultados sugieren que la autofagia mitocondrial juega un papel clave en la lesión de los cardiomiocitos inducida por Dox. La remodelación de la red metabólica del corazón por sí sola no puede compensar completamente la disfunción causada por la lesión mitocondrial, y el efecto protector miocárdico de la breviscapina depende de la regulación del metabolismo de la glucosa y los lípidos y de la activación de la autofagia mitocondrial. Esta también puede ser la razón por la cual no se ha considerado la regulación de la red metabólica cardíaca con respecto a la hipótesis del desarrollo de CID. Se sugiere que prevenir la progresión de la enfermedad y restaurar la función cardíaca debería ser igualmente importante en el tratamiento de los síntomas de disfunción e insuficiencia cardíaca causadas por Dox, lo que es más beneficioso para el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes.

Los autores agradecen a W-SS, Instituto del Cáncer del Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao, China, por la preparación del borrador original y la curación de datos.