抽象的な
客観的：
応答曲面法 (RSM) を使用して、Herba Polygoni Capitati (中国語では豆花寮) からのクエルシトリンと総フラボノイド (TF) の抽出条件を最適化します。
材料と方法：
中心複合設計 (CCD) を採用して、溶媒組成 (%)、溶媒と材料の比率 (ml/g)、抽出時間 (分) を含む 3 つの独立変数が応答、クエルシトリンおよび TF 収量に及ぼす影響を調査しました。
結果：
最適化された抽出条件は次のとおりです。エタノール濃度、65.63%。溶媒と材料の比、10.55:1 (ml/g)。抽出時間、54.33分。確立された数学的モデルは実験パラメータの要因をよく説明しており、クエルシトリンと TF の最適収率を統計的に正確に予測できました。
結論：
実験値は、確立された数学モデルによって予測された値と一致し、使用されたモデルが適切であり、RSM が抽出条件の最適化に成功したことを示しています。
導入
Herba Polygoni Capitati、の地上部分または植物全体 タデ ブフハム。 ex D. Don は、中国、特に一部の少数民族地域で、伝統的な中国医学 (TCM) の 1 つとして長い間使用されてきました。 Herba Polygoni Capitati の活性化学成分は、フラボノイド、フェノール酸、タンニンとして特定されました。1,2,3］では、フラボノイドが主要な生理活性化合物として考えられていました。薬理学的研究および臨床研究により、ケルセチンとそのグルコシドは抗がん作用を有する生理活性化合物であることが示されました。4,5] 抗酸化[6,7] および酵素調節活性。[8,9,10] 疫学研究では、フラボノイド (主にケルセチン) の多量摂取と心血管疾患との間に逆相関があることも示しています。11]
TCM の抽出物は、世界中で何世紀にもわたって伝統的な治療法やハーブ療法に使用されてきました[12,13』と多くの貴重な経験がこの治療システムに蓄積されてきました。喘息治療薬のうっ血除去剤として使用されるアンフェタミン様興奮剤であるエフェドリンは、中国の薬草から抽出および単離されました。 マオウ.[14』の抜粋です。 イチョウ特に標準化されたEGb 761は、認知症と認知障害に対して最も広く使用されている漢方薬の1つでした。[15[16]
Herba Polygoni Capitati で発表されたすべての化合物の中で、フェノール酸とフラボノイド成分が最も注目されており、その薬理学的効果が重要であると考えられていました。17] 一度に 1 要素ずつのアプローチのみによる Herba Polygoni Capitati からの没食子酸 (GA) または TF の抽出、[18] または直交計画に関連付けられている、[19』については以前にもお伝えしました。一度に 1 つの因子のみを変数とし、他のすべての因子を一定に保つアプローチ。[20] は時間がかかり、因子間の相互作用効果が含まれていないため、誤解を招く結論を招く可能性があります。直交計画はテスト設計に役立ちます[21] しかし、モデル方程式からの予測は提供されません。統計的および数学的手法を集めた応答曲面法 (RSM) は、変数間の起こり得る相互作用効果を考慮に入れるため、これらの欠点を克服できます。[22,23] 独立したパラメーターの関数としての応答の応答曲面プロットと等高線プロットは、RSM によって取得できます。[24本研究では、クエルシトリンとTFの収量を同時に最大化するために、RSMアプローチを適用してHerba Polygoni Capitatiからの抽出条件（溶媒比率、溶媒と材料の比率、抽出時間など）を最適化しました。
材料と方法
材料と化学品
Deyuan Chen 教授によって植物学的に同定された Herba Polygoni Capitati は、中国貴州省の Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation から入手されました。 Herba Polygoni Capitati の全草を、強制対流式万能オーブン (101-2AB Taijin、中国) で 50°C で 4 時間乾燥させました。乾燥したサンプルをロータリーミル (DFY-200 Wenling、中国) で粉砕し、粉末をふるいにかけました。研究のために、10 ～ 40 メッシュ (内径 0.3 ～ 2 mm) の粒子を収集しました。参照化合物のクエルシトリン (111538-200403) およびルチン (080-9303) は、中国生物医薬品管理国立研究所 (中国、北京) から購入しました。アセトニトリルとメタノールは HPLC グレード (Tedia、米国) でした。水は、堅牢な飲料用純水（Le Bai Shi Food and Beverage Ltd.、広東省）であった。ギ酸は MS グレード (Roe Scientific Inc、米国) でした。他のすべての化学物質と溶媒は分析グレードのものであり、市販されています。
サンプルの準備
Herba Polygoni Capitati 粉末 2g を正確に秤量し、特定の条件下で抽出し、その後抽出物を 3500 で遠心分離しました。 回転数 10分間上清を収集し、その後の分析のために濾紙で濾過した。
装置
この研究で使用した分析システムは次のとおりです。紫外可視スペクトルは、光路長 1 cm のセルを備えたダブルビーム分光光度計 (Cary 100-Varian) で記録しました。クロマトグラムの取得には、真空脱気装置、四次ポンプ、オートサンプラー、恒温カラムコンパートメント、および DAD 検出器 (DIONEX、ThermoFisher、米国サニーベール) で構成される DIONEX/UltiMate 3000 シリーズ UHPLC-DAD システムを使用しました。
総フラボノイド含有量の測定
総フラボノイド含有量 (TFC) は、前述のアルミニウム比色法に従って決定されました。25,26,27,28』に修正を加えたものです。簡単に説明すると、各植物抽出物のアリコート (0.5 ml) を 4.3 ml の関連溶媒と混合し、続いて 0.1 ml の 10% 塩化アルミニウム (AlCl) を加えました。3) および 1M 酢酸ナトリウム (CH ) 0.1ml3 COONa）。ルチンを参照標準として使用しました。室温で 30 分間インキュベートした後、反応混合物をブランクに対して 405nm で測定しました。各サンプルの TFC 値を計算し、乾燥材料 (DM) 1 グラムあたりのルチン当量のミリグラムとして表しました。
クロマトグラフィーによる分離
抽出物のＨＰＬＣ分析は、ＤＩＯＮＥＸ／ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００シリーズを使用して実施した。分離はZORBAX SB-Cで実行されました18 カラム (150 mm × 4.6 mm、5 μm; Agilent、カリフォルニア州、米国) を流速 1.0 ml/min で使用します。移動相は、A (アセトニトリル) と B (0.2% ギ酸水溶液) の組み合わせから構成されていました。直線勾配は 5% から 15% A でした (v/v) 5 分で 16% A に、10 分で 16% A に、20 分で 20% A に、その後 22 分間 20% A に保持されました。各実行の後に 5 分間の平衡時間が続きました。 UV 検出器の波長は 260 nm に設定し、カラムオーブンの温度は 30℃に維持しました。注入前にサンプルを濾過した(PTFEシリンジフィルター; 0.45μm; Hanbon Ltd, China; 013045)。データは Chromeleon 7.1 ソフトウェアで収集および分析されました。
標準液の調製
ルチンおよびクエルシトリンの標準ストック溶液を、メタノール中でそれぞれ190.8μg/mlおよび106.0μg/mlの濃度で調製した。クエルシトリンとTFの標準曲線は、それぞれピーク面積と吸光度から導出された線形最小二乗回帰式を使用して校正され、サンプル中のクエルシトリンとTFの濃度は標準曲線に従って計算されました。
適切な抽出条件の選択
RSM を使用して研究を進める前に、関連する独立変数を選択し、その実験範囲を決定するために一連の予備テストが実行されました。予備実験の最初のステップは、Herba Polygoni Capitati の抽出に適切な方法を選択することでした。 3 つの異なるアプローチ、つまり浸軟、還流、超音波処理抽出をテストしました。予備実験の 2 番目のステップは、Herba Polygoni Capitati に適切な抽出溶媒を選択することでした。 0 ～ 100% の範囲で変化する一連の抽出溶媒 (エタノールまたはメタノール水溶液) を使用して、最適な溶媒を決定しました。第三に、溶媒と材料の比率 (6:1、8:1、10:1、12:1、14:1; v/m) 抽出時のエタノール:水 (70:30、 v/v) を溶媒として用い、室温で 30 分間の超音波処理条件で抽出します。第 4 に、さらなる調査のために適切な粒子サイズが選択されました。最後に、抽出時間 (10 分、20 分、30 分、40 分、50 分、60 分) もテストしました。
これらの結果に基づいて、応答パターンを分析してモデルを確立するために、関連する各変数の 3 つのレベル (下位、中位、上位) が中央複合計画 (CCD) 用に選択されました。
統計分析
CCD手順から得られた実験データは、RSMを使用して次の二次多項式モデル(式(1))に適合させることによって分析され、回帰係数が得られました。
X の場所1、 バツ2、…、 バツk 応答 Y に影響を与えるエンコードされた独立変数です。 β0、β私 (i = 1、2、…、k)、βii (i = 1, 2,…, k) および βij (i = 1, 2,…, k) は、それぞれ切片項、線形項、二次項、交互作用項の回帰係数です。 k は変数の数です。
Design Expert バージョン 8.0.5b (STAT-EASE Inc.) ソフトウェアを、実験データの回帰およびグラフ分析に使用しました。モデルの適合性の品質は、決定係数 (R2) および分散分析 (ANOVA)。応答曲面と等高線プロットは、近似された 2 次多項式を使用して作成されました。
結果と考察
システム精度、HPLC または UV-Vis の直線性
抽出効率を評価するマーカーとしてクエルシトリンとTFを指定した。参照標準および Herba Polygoni Capitati 抽出物の HPLC プロファイルを以下に示します。 図1。クエルシトリンのレベルに対するピーク面積の検量線は次のとおりです。 y = 47.622 バツ − 0.033 ～ 1.06 μg の線形範囲で 0.2231 (R2 = 1.0000, y = ピーク面積と バツ =ケルシトリン量)。 TF 量に対する吸光度の検量線は次のとおりです。 y = 0.0029 バツ – 74.32 ～ 267.12 μg の線形範囲で 0.0088 (R2 = 0.9996, y = 吸光度と バツ = TF 量)。
クエルシトリンの認証済み参照化合物 (a) および Herba Polygoni Capitati の抽出物 (b) の 260 nm での HPLC クロマトグラム
パラメータの決定とレベルの選択
抽出方法の効果
浸軟、還流、超音波処理抽出を含む 3 つの異なる抽出方法を、次のパラメータ値でテストしました。粒子サイズ、10 メッシュ。溶媒と材料の比、10:1 (ml/g)。抽出時間、還流および超音波抽出は 30 分、浸軟抽出は 12 時間。溶媒組成、70% 水性エタノール。温度、室温。 DM 1 グラムあたりに抽出されたクエルシトリンと TF の量は、次のように表示されます。 図2。実験結果の ANOVA では、これら 3 つの抽出方法間で有意な差が示されました (P < 0.01)。一方、超音波抽出法がクエルシトリンとTFの収率が最も高かったため、抽出法として選択しました。
Herba Polygoni Capitati からのケルシトリン (左) と TF (右) のさまざまな抽出方法の影響
抽出溶媒の影響
溶媒は分析物の回収に影響を与える重要な要素です。本研究では、水、さまざまな濃度のメタノール、およびさまざまな濃度のエタノールをテストしました。に示すように 図360% 水性エタノールの抽出効率が最も高かった。したがって、さらなる RSM 調査のために、50%、60%、および 70% エタノールを溶媒組成の下位、中位、および上位レベルとして選択しました。
Herba Polygoni Capitati からのクエルシトリンと TF の超音波支援抽出に対する溶媒組成の影響
溶媒と材料の比率
抽出に対する溶媒と材料の比率の影響は、5 つの値 (6:1、8:1、10:1、12:1、14:1; v/m）。適切な溶媒と材料の比率の値は、ルールに基づいて選択されます[29] 値が小さすぎても (生理活性化合物を完全に抽出できない)、高すぎても (処理コストが耐えられない) もいけません。で紹介されているように、 図4、クエルシトリンとTFの収量の増加傾向が観察され、比率が約10:1のときに最高値に達しました。考えられる説明は、溶媒と材料の比率が増加すると、細胞内への溶媒の拡散性が増大し、細胞からのフェノール化合物の脱着が促進される可能性があるということでした。[30本研究では、比率の値が 10:1 より高い場合、クエルシトリンと TF の収量のわずかな減少が観察されました。これは、生成物の収集またはプロセス操作における損失が大きくなったことが原因である可能性があります。したがって、その後の研究では、溶媒と材料の比率を RSM の中間レベルとして 10:1 に設定しました。
クエルシトリンとTFの収率に対する溶媒と材料の比率の影響
粒子サイズの影響
粒子サイズも考慮すべき重要な変数です。一般に、抽出効率は粒子サイズが小さくなるほど増加します [図5]。本研究では、粒子サイズは直径 0.45 ～ 0.9 mm に設定されました。
クエルシトリンおよびTFの収量に対する粒子サイズの影響
RSMによる抽出パラメータの最適化
重回帰結果と近似モデルの妥当性の分析
20 回の実験実行からなる 3 要素および 3 レベルの回転可能な CCD を使用し、中心点で 6 回の反復を行いました。説明できない変動性の影響は、実験の順序をランダム化することによって最小限に抑えられました。独立変数は溶媒組成 (X1, %, v/v、エタノール/水)、溶媒と材料の比率 (X2、ml/g) と抽出時間 (X3、min) クエルシトリンと TF 収量を指標として使用します。固定粒子サイズ (0.45 ～ 0.9 mm) が選択されました。すべての実行のクエルシトリンおよび TF 収量を以下に示します。 表1。これらの結果に基づいて、２次多項式モデル（式（１））を用いた多重線形回帰を行った。
表1
独立変数 (X) の元のコード化形式での回転可能な中央複合設計設定1、 バツ2、 バツ3) と応答変数、クエルシトリンおよび TF の実験結果
独立変数の ANOVA を図に示します。 表2 これら 3 つの独立変数すべてが抽出効率に大きく影響することを示します (P < 0.05)。複数の決定の対応する係数を備えた近似二次モデルの回帰パラメーター (R2）に示されました。 表3。良好なフィッティングが達成され、応答の変動性がモデルによって説明されました。高い R2 クエルシトリンとTFのそれぞれの値0.94と0.96は、実験データがモデルによって予測されたデータとの互換性を確認していることを意味します。変動係数の低い値 (クエルシトリンの場合は 1.92%、TF の場合は 3.28%) は、適合モデルから得られた結果が信頼できることを示しています。調整された決定係数 (R2 Adj.) 値は、すべての * 重要な用語を含めて式を再構築し、 R2 調整(R2 調整それぞれ 87%、92% に等しい) は、モデルの重要性を裏付けています。
表2
応答曲面二次モデルの分散分析
表3
応答変数、ケルシトリンおよび TF の予測 2 次モデルの回帰係数
モデルの適合性が適切であることを検証するために、不適合テストが使用されました。不適合検定の ANOVA は、クエルシトリンと TF の収量に関して有意ではありませんでした (P > 0.05)、モデルが実験データに適切に適合できることを示しています [表4].
表4
クエルシトリンと TF の不適合テストの分散分析
応答曲面の解析
以来;モデルは良好なフィッティングを示し、応答値は回帰式によって十分に説明されます。独立変数の相互作用を実証し、最大応答に対する各独立変数の最適値を決定するために、応答曲面曲線がプロットされました。独立変数と従属変数の間の関係は、3 次元 (3D) 応答曲面プロットと 2 次元 (2D) 等高線プロットで示されました。 3D 応答曲面と 2D 等高線プロットは、回帰式のグラフ表示として提供されました [図 [図7]7 そして および8]。8]。各等高線曲線は、2 つの独立変数の無限数の組み合わせを表し、もう一方の独立変数は静止点に維持されます。このようにして、3D 応答曲面を容易に視覚化できます。 図7a 溶媒組成および溶媒と材料の比率のモデルによって展開された 3D 応答曲面関数を示します。溶媒組成は応答に対して二次的な効果を示しました。クエルシトリンの含有量は、65% エタノールを使用したときに最高値に達します。同様に、溶媒と材料の比率は、クエルシトリンに対する二次的な効果も同時に実証しました。溶媒組成および溶媒と材料の比率が TF に及ぼす影響の結果を以下に示します。 図8a。溶媒組成は、応答に対して二次的な効果を示し、60% と 70% エタノールの間で最大値が得られました。同様に、溶媒組成を固定して溶媒と材料の比率を増加させると、TF は徐々に増加し、溶媒と材料の比率が約 10:1 のときに最高値に達しました。
クエルシトリンの収率に対する溶媒組成 (X1)、溶媒材料比 (X2)、および抽出時間 (X3) の影響を示す応答曲面プロット (a、c、および e) および等高線プロット (b、d、f)
TF の収率に対する溶媒組成 (X1)、溶媒材料比 (X2)、および抽出時間 (X3) の影響を示す応答曲面プロット (a、c、および e) および等高線プロット (b、d、f)
クエルシトリンおよびTF収率の応答値に対する独立変数溶媒組成および抽出時間の影響を図に示します。 図7c、7c, 、7d、7日, 、8c、8c, 、8d、8d、 それぞれ。 2 つの独立変数間の相互作用関係は、他の独立変数である溶媒と材料の比率を定常点で一定に保つことによって生成された等高線プロットを調べることで簡単に理解できます。 [図7d]7日 そして そして8d]。8d]。クエルシトリンと TF の収率の増加は、溶媒組成と抽出時間の増加により大幅に達成されました。ただし、独立変数が特定の値を超えると、クエルシトリンと TF の収量は増加しなくなりました。溶媒組成と抽出時間の相互作用は、クエルシトリン収量に与える影響において統計的に有意ではありませんでしたが、有意な影響を及ぼしました (P < 0.01) TF の抽出に対する影響。
数字 図7e7e そして そして8e8e は、溶媒と材料の比率と抽出時間がクエルシトリンと TF の収量に及ぼす影響を実証しました。抽出時間および溶媒-材料比の増加に伴い、クエルシトリンおよびTFの収率の増加が観察されました。これは、クエルシトリンおよびTFの抽出収量が抽出時間および溶媒-材料比に比例することを示唆しています。 Herba Polygoni Capitati からのケルシトリンと TF の抽出に関する 2 つの独立変数の相互作用は、統計的に有意ではありませんでした。
実証実験
モデルの予測能力を検証するために、RSM のリッジ解析から導出された最適化された条件下で最適な応答変数がテストされました。その結果、観測値はモデルからの予測値の 95% 信頼区間内で満足のいく値を達成できました。表5].
表5
応答変数であるクエルシトリンとTFの予測値と観測値の比較
結論
CCD と組み合わせた一度に 1 要素のアプローチを使用することにより、溶媒組成、溶媒と材料の比率、抽出時間を含む超音波支援抽出パラメータが、Herba Polygoni Capitati からのケルシトリンと TF の抽出用に最適化されました。結果は、2 次多項式モデルが抽出データを十分に記述していることを示しました。最適化された条件は次のとおりです。抽出方法、超音波処理抽出。溶媒は65%水性エタノールで丸めるのが良いかも知れません。粒子サイズ、0.45-0.9 mm。溶媒と材料の比率、10:1 に丸めます。抽出時間は 54 分に丸められます。この研究は、Herba Polygoni Capitati の工業的抽出プロセスに関する基礎情報と貴重な洞察を提供します。
謝辞
著者らは、原材料の提供と貴州省主要科学技術特別プログラム (No. 2011 6019-02)、医薬品分析に関する貴州省科学技術イノベーション人材チーム (No. . 2011 4008)、中医学の近代化に関する科学技術産業の研究開発に関する貴州省特別プログラム (番号 ZY 2011 3013)、漢方薬および国民薬の標準化の特徴的重点研究室および貴州省の特徴的重点研究室県教育局。 (番号 KY 2012 005)。
参考文献
Japanese 
English 
Chinese 
Spanish 
Korean 
Vietnamese 
Thai 
French